Domain architecture of inhibitory ionchannels of the cys-loop receptor family

Die spontane Mausmutante Oscillator trägt eine Mutation im Glra1-Gen und eignet sich hervorragend zur Untersuchung von motorischen Bewegungsstörungen, die mit Glycinrezeptor- (GlyR) mutationen assoziiert sind, da die Mäuse ähnliche phänotypische Symptome aufweisen wie Hyperekplexie-Patienten. In Anlehnung an die Oscillator-Proteinvariante wurde eine verkürzte GlyRα1 Untereinheit in vitro generiert, der ein Großteil der TM3-4 Schleife, die TM4 sowie der C-Terminus fehlte. Wurde dieser fehlende C-terminale Bereich als ein unabhängiges Komplementationskonstrukt in HEK293-Zellen mit der verkürzten α1 Variante kotransfiziert, waren die GlyR-Domänen in der Lage, sich zu einem funktionellen Ionenkanal zu assemblieren. Um den zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen, wurde das Komplementationskonstrukt am intrazellulären N-Terminus sukzessive verkürzt. Bei Verwendung der bis zu 49 Aminosäuren verkürzten Konstrukte konnte, im Gegensatz zu stärker verkürzten Konstrukten, eine funktionelle Komplementation beobachtet werden. Als Ursachen für das Abbrechen der Funktionalität wurden sowohl eine falsche Orientierung der Konstrukte in der Plasmamembran als auch eine fehlerhafte Pentamerisierung experimentell ausgeschlossen. So mussten die Trunkierungen entweder ein bestimmtes Interaktionsmotiv deletieren oder die intrazelluläre Domäne so stark verkleinern, dass kein sterischer Kontakt zwischen den Domänen mehr möglich war. Vermutlich bilden die negativ geladenen Aminosäuren des Komplementationskonstruktes eine ionische Wechselwirkung mit dem basischen Motiv „RRKRR“ am Ende der verkürzten α1-Variante aus, da die Funktionalität mit der Deletion dieser negativen Ladungen abbrach. Weiterhin wurden ebenfalls keine funktionellen Kanäle komplementiert, sobald beide Termini positive Ladungen trugen. Dennoch schien zusätzlich eine Mindestlänge der intrazellulären Domäne erforderlich zu sein, da auch das Anbringen von negativen Aminosäuren an die stark verkürzten Konstrukte nicht zu einer Wiederherstellung der GlyR Funktion führte. Dies gelang hingegen durch Zugabe der TM3-4 Schleife, als eine dritte, unabhängige Domäne. Diese fungierte vermutlich als Brücke zwischen den beiden weiteren Domänen, um die durch Ligandenbindung ausgelöste Konformationsänderung bis zur TM3 auf die TM4 und den C-Terminus zu übertragen und so eine Kanalöffnung zu ermöglichen. Neben einer direkten Interaktion der GlyR Domänen mittels ionischer Wechselwirkungen ist auch eine indirekte Interaktion vorstellbar, die über noch unbekannte Proteine vermittelt wurde. Der nächste Schritt bestand in der Überführung der Komplementationsexperimente in eine in vivo-Situation. Hierfür sollte der neurologische Phänotyp der Oscillator-Mäuse durch Einbringen der fehlenden C-terminalen Domäne in Form eines Transgens aufgehoben werden. Jedoch wurde durch eine Vielzahl von Methoden gezeigt, dass das generierte Transgen nicht auf Proteinebene exprimiert war. Da die Topologie in der gesamten Superfamilie der Cys-Loop-Rezeptoren sehr ähnlich ist, sollte anhand der α1β2γ2-Isoform des GABAA-Rezeptors untersucht werden, ob der Mechanismus einer Komplementation auch auf weitere Subfamilien übertragbar ist. In Epilepsie-Patienten (GEFS+) wurde eine Mutation identifiziert, die zu einer verkürzten γ2-UE führt, vergleichbar der Oscillator-Mutation. Diese verkürzte γ2-trc Variante und ein entsprechendes Komplementationskonstrukt (γ2_iD TM4) wurden kloniert. Die Expression aller GABAAR-Domänen wurde in HEK293-Zellen nachgewiesen, jedoch wurde γ2-trc, auch in Kombination mit dem Komplementationskonstrukt, nicht an die Plasmamembran transportiert. Folglich wurden keine funktionellen α1/β2/γ2-trc/γ2_iD TM4 Rezeptorkomplexe ausgebildet.The spontaneous mouse mutant Oscillator carries a mutation in the Glra1 gene and shows a phenotype similar to human patients suffering from hyperekplexia. Thus, Oscillator is an excellent model to study neuromotor disorders, which are associated with glycine receptor (GlyR) mutations. Based on the Oscillator protein, a truncated GlyRα1 subunit was generated in vitro, which lacks most of the TM3-4 loop, the TM4 and the C-terminus. If the missing C-terminal complementation construct was cotransfected in HEK293-cells together with the truncated α1 variant, GlyR-domains were able to assemble into a functional ion channel. To investigate the underlying mechanism the N-terminus of the complementation construct was successive shortened. A functional complementation of GlyR-domains was observed up to a deletion of 49 amino acids from the N-terminus of the complementation construct in contrast to larger truncations. A wrong orientation into the plasma membrane as well as a defect in oligomerisation was excluded as a reason for the loss of function. Hence, the truncations led to a deletion of a specific interaction motif or reduced the intracellular domain until no steric contact was possible between the domains. A deletion of the negative charged amino acids of the complementation construct resulted most probably in a disappearance of functional ion channels. Therefore, these negative charges probably form an ionic interaction with the basic “RRKRR” motif at the end of the truncated α1-variant. Neither any functional receptor was observed if both termini carried positive charges. Nevertheless, a minimum length of the intracellular domain seemed to be required, because the addition of negative charges to the most truncated tails did not lead to a recovery of GlyR function. The reconstitution was, however, successful using the TM3-4 loop as a third independent construct together with the truncated α1-variant and the C-terminal tail. Thus, the loop represents an important factor in the process of conformational rearrangements following ligand binding, which results in channel opening. Beside the direct interaction of the GlyR domains via ionic interaction, an indirect binding mediated by unknown proteins is also possible. The next step was to bring these complementation experiments in an in vivo situation. Therefore, it was intended to rescue the neurological phenotype of Oscillator mice using a transgene consisting of the missing C-terminal GlyR part. However, the transgene was not expressed on the protein level, which was shown with various methods. The topology of the cys-loop receptor superfamily is very similar. For that reason it was investigated on the basis of the α1β2γ2 GABAA receptor if the mechanism of a complementation is transferable to other family members. In patients of a particular form of epilepsy (GEFS+) a mutation was identified, which lead to a truncated γ2-subunit comparable to the Oscillator-mutation. This truncated γ2-trc variant and an appropriate complementation construct (γ2-iD-TM4) were cloned. The expression of all GABA receptor domains were demonstrated in HEK293-cells, but the γ2-trc and γ2-iD-TM4 were not transported to the plasma membrane. Thus, no functional α1/β2/γ2-trc/γ2_iD-TM4 receptor complexes were formed