Estrategia de terapia génica para el tratamiento de la Hepatoencefalopatía COXPD1

La Hepatoencefalopatía por deficiencia combinada de fosforilación oxidativa tipo 1 (COXPD1) es una enfermedad mitocondrial causada por una mutación en el gen GFM1 que codifica para el factor de elongación G1 (EFG1). Se trata de un factor de esencial para la síntesis de proteínas mitocondriales. Así, defectos en el mismo pueden desencadenar un trastorno multisistémico, de inicio precoz, que generalmente provoca la muerte de los pacientes en los primeros meses/años de vida, y dificulta el estudio de la enfermedad y consecuentemente su tratamiento. Es por ello que en los últimos años la investigación se ha dedicado al desarrollo de modelos animales de COXPD1 que reproduzcan el fenotipo de los pacientes. La generación de ratones Wt (Gfm1+/+), Ki (Gfm1R671C/R671C) y Ki/K0 (Gfm1R671c/-) ha sentado las bases para el inicio de nuevos ensayos de terapia génica. Por lo tanto, el presente estudio busca desarrollar una estrategia basada en la edición de genes con el sistema CRISPR/Ca9, que permita la corrección eficiente de la mutación c.2011C>T por su amplia presencia en pacientes y su relación con una mayor supervivencia. Requiriendo una extensa etapa de caracterización del fenotipo de los fibroblastos embrionarios obtenidos de los ratones modelo, seguido de un estudio exhaustivo de las mejores condiciones de diseño CRISPR y las condiciones de manipulación más adecuadas para la línea celular diana, y finalizando con la puesta a punto de protocolos apropiados. También fue posible caracterizar las necesidades metabólicas en presencia de la mutación R671C, desarrollar una estrategia de selección basada en la competencia celular para facilitar el aislamiento de los clones después de la edición, e incluso determinar comportamientos de respuesta adaptativa llamativos.<br /

Patología mitocondrial debida a mutaciones del gen FARS2. Patogenicidad de una nueva mutación.

La secuenciación del exoma ha resultado ser una herramienta muy importante para el diagnóstico de enfermedades de base genética en la infancia. El objetivo de este trabajo es analizar los pacientes descritos en la literatura con mutaciones patológicas en FARS2 (que codifica la Fenilalanil-ARNt sintetasa mitocondrial) y compararlos con un nuevo paciente diagnosticado recientemente en España con una mutación en este gen. Este paciente presenta una mutación puntual c.1256G>A (p.Arg419His) y una deleción del exón 3 en FARS2. Cinco de los siete pacientes conocidos diagnosticados de esta mutación tienen unas características clínicas compatibles con el Síndrome de Alpers, otro de ellos tiene una Paraplejía espástica hereditaria, mientras que la clínica de nuestro paciente es compatible con el Síndrome de Leigh. Las diferencias clínicas entre pacientes con una mutación en el mismo gen pueden deberse entre otras causas a la diferente localización de la mutación dentro de ese gen, afectando en cada caso a aminoácidos diferentes. Esto va a influir también en la edad de supervivencia de cada paciente. En tres de los trabajos que se han revisado se demostraba mediante estudios funcionales la relación entre la mutación que describen en FARS2 y la alteración de la función de la Fenilalanil-ARNt sintetasa lo que lleva a una disminución en general de la capacidad de carga del ARNt. Este estudio informa de una nueva mutación patológica en FARS2 a la vez que establece una nueva causa genética nuclear del Sindrome de Leigh

Comparación de fenotipos de pacientes con mutaciones en FBXL4

FBXL4 es un gen situado en el DNA nuclear, en el cromosoma 6q16.1. Este gen codifica un miembro de la familia de las proteínas F-box, la cual forma parte de un complejo con un importante papel en la ubiquitinación dependiente de fosforilación. Hasta el momento se han descrito 31 mutaciones distintas en 36 familias diferentes, entre ellas 19 de cambio de sentido, 6 de pérdida de sentido, 3 deleciones y 3 mutaciones en los sitios de corte y empalme (splicing) Las mutaciones patológicas encontradas hasta la fecha provocan un cuadro de encefalomiopatía de comienzo temprano, que se manifiesta con frecuencia desde el primer día de vida. A pesar de ser una entidad relativamente heterogénea, podemos cuadro clínico típico de un paciente con mutación de FBXL4 como un neonato de bajo peso al nacer que desde el comienzo presenta hipotonía, dificultad para la alimentación y rasgos dismórficos faciales, que analíticamente presenta una acidosis con un lactato muy elevado y en el que se realiza una RMN donde se detectan alteraciones de la señal en T2 junto a atrofia cerebral. No mejora a pesar de los tratamientos y con el paso del tiempo se constata un retraso del desarrollo En el presente trabajo, a partir de los informes clínicos de dos pacientes no publicados todavía que están siendo estudiados en el Grupo de Biogénesis y Patología Mitocondrial del Departamento de Bioquímica de la Facultad Ciencias de la Universidad de Zaragoza, se realiza una comparación entre estos pacientes y aquellos publicados en la literatura, al tiempo que se lleva a cabo una revisión bibliográfica acerca de todos los pacientes con mutaciones en FBXL4 publicados hasta la fecha. En los pacientes estudiados se han encontrado 3 mutaciones: dos de ellas de pérdida de sentido y una de alteración de corte y empalme que lleva a un cambio en la pauta de lectura. Presentan características fenotípicas habituales, como son el retraso del desarrollo, la elevación de ácido láctico en la analítica, o la depleción del mtDNA en la biopsia muscular, lo cual permite orientar el diagnóstico previamente al análisis genético

Análisis de la tasa de traducción mitocondrial de fibroblastos embrionarios de ratón con hepatoencefalopatía COXPD1

La hepatoencefalopatía por deficiencia combinada de fosforilación oxidativa de tipo 1 (COXPD1) es una enfermedad mitocondrial causada por mutaciones en el gen GFM1 que codifica el factor de elongación mitocondrial G1 (EFG1). El estudio de diversos pacientes reveló una alteración en la secuencia de GFM1, un cambio de aminoácidos en la posición p.671 de Arginina a Citosina (p.R671C). Se generaron modelos permitieran estudiar la enfermedad, ratones portadores de la mutación p.R671C en homocigosis (Gfm1R671C/R671C). Sin embargo, su leve fenotipo condujo al intento fallido de obtener modelos knock-out para Gfm1, pero estos ratones sufrían letalidad embrionaria con el alelo en homocigosis. Como alternativa se generaron ratones heterocigotos con uno de sus alelos knock-out y otro con la mutación p.R671C (Gfm1-/R671C). Los fibroblastos de estas líneas de ratones se estudiaron en este trabajo. El análisis de los fibroblastos embrionarios ratón (MEFs) reveló niveles de EFG1 reducidos en la línea Gfm1-/R671C. Sin embargo, los niveles de EFG1 en la línea con un fenotipo más leve (Gfm1R671C/R671C) incrementaron ligeramente. Las dos líneas celulares con Gfm1mutado mostraron reducción en los niveles de COI, subunidad I del complejo IV o Citocromo c oxidasa de la cadena de fosforilación oxidativa. Esta expresión disminuida pudo observarse en el análisis mediante Western Blot e inmunocitoquímica. COI, proteína del sistema OXPHOS, es codificada por el DNA mitocondrial y sintetizada en los ribosomas mitocondriales, proceso en el que EFG1, factor de elongación tiene un papel fundamental. No se logró medir la tasa de traducción mitocondrial con la química click. Aunque se observó marcaje, es necesario optimizar el protocolo para las líneas celulares en estudio. <br /

Estudio de patogenicidad de mutaciones en el gen CHCHD6

La membrana interna mitocondrial se organiza en estructuras denominadas crestas, que son importantes para el funcionamiento de la mitocondria. Los complejos de la cadena respiratoria I-IV y F1F0-ATP sintasa (CV) se localizan en las crestas y realizan el proceso de fosforilación oxidativa (OXPHOS) que produce ATP para la célula. El sistema MICOS (Sistema de contacto mitocondrial y organización de crestas) es importante en la formación y mantenimiento de las crestas. Se localiza en la zona de unión de crestas, que separa los dos dominios de la membrana interna: el dominio paralelo entre membranas y el dominio de crestas. El sistema MICOS se divide en dos subcomplejos: subcomplejo Mic60 y subcomplejo Mic10. Subunidades del sistema MICOS también se han relacionado con la estabilidad del mtDNA y con el importe de proteínas a la mitocondria. En el presente estudio se ha trabajado con fibroblastos derivados de un paciente al que, mediante secuenciación masiva, se le encontraron mutaciones en el gen CHCHD6/Mic25. CHCHD6/Mic25 es una proteína periférica de la membrana interna, orientada hacia el espacio intermembrana y forma parte del subcomplejo Mic60. Nuestros resultados indican que los fibroblastos con mutaciones en CHCHD6/Mic25 tienen niveles de ATP menores que el control y que poseen una estructura de crestas alterada. Los niveles de expresión de las demás proteínas del subcomplejo no cambian, aunque se observó un aumento de la expresión de subunidades del sistema OXPHOS. Se intentaron llevar a cabo estudios de complementación funcional, sin embargo, la sobreexpresión del gen resultó tóxica para las células. Bajos niveles de ATP mitocondrial y la alteración en las crestas indican que las mutaciones tienen efecto, sin embargo, es necesario modular la expresión del gen CHCHD6/Mic25 para confirmar la patogenicidad de las mutaciones en nuestro paciente.<br /

Nuevas mutaciones en POLG asociadas a epilepsia y retraso psicomotor.

Estudiamos el caso de una niña de 4 años con clínica compatible con posible enfermedad mitocondrial. En el estudio genético mitocondrial se descartan mutaciones y delecciones del DNA mitocondrial, por lo que se decide secuenciar el exoma, encontrando dos mutaciones nucleares, ambas recesivas, en el cromosoma 15. Las dos mutaciones afectan al gen que codifica para la POLG. La primera mutación p.A1217P no está descrita en la literatura, mientras que la segunda p.N864S está descrita únicamente en dos hermanas. Comparamos el informe de nuestra paciente con el de las dos hermanas y con un control p.Y955C, extraído de la literatura, en busca de similitudes en la herencia, clínica, histología, bioquímica y tratamiento de las tres entidades. Asimismo, estudiamos complementación funcional en fibroblastos en busca de la repercusión bioquímica de las dos mutaciones de nuestra paciente.<br /

Primer caso de enfermedad mitocondrial asociada a mutaciones puntuales en el gen ATAD3C

Las enfermedades mitocondriales suponen un conjunto de patologías caracterizadas por la alteración de los procesos de producción de energía. Estas pueden ser provocadas por mutaciones nucleares o por mutaciones en el propio material genético del orgánulo. Recientemente se ha descrito que la presencia de determinadas alteraciones en los genes del locus ATAD3 del cromosoma 1 puede ser causa de este tipo de afectaciones. Un único gen ATAD3 ha sido detectado en múltiples especies con un alto grado de conservación a lo largo de la evolución. En primates y humanos, este se ha duplicado dos veces en tándem dando lugar a un clúster formado por los genes ATAD3A, ATAD3B y ATAD3C.Las proteínas codificadas por los genes de este clúster pertenecen a la familia de las ATPasas asociadas a diversas actividades celulares o AAA-ATPasas. Al igual que ocurre en todas las proteínas de esta familia, se piensa que los monómeros de ATAD3 se unen formando hexámeros que, en este caso, se encontrarían anclados a la membrana interna mitocondrial. A pesar de que su función todavía no se ha definido, se cree que son fundamentales en los procesos de biogénesis y dinámica mitocondrial, en el mantenimiento de estructuras específicas del orgánulo y en la organización del DNA mitocondrial en torno a unas estructuras denominadas nucleoides. Del mismo modo, parecen fundamentales en la regulación del metabolismo lipídico.Desde el año 2016 se ha registrado un total de 50 pacientes que padecen enfermedades mitocondriales relacionadas con mutaciones en estos genes. El fenotipo de estos pacientes incluye alteraciones intrauterinas, retraso en el desarrollo psicomotor, sintomatología neurológica y afectación ocular y cardiaca. También es frecuente encontrar alteraciones del sistema nervioso central en pruebas de imagen así como niveles altos de lactato en la analítica sanguínea. En este trabajo presentamos al primer paciente diagnosticado de enfermedad mitocondrial relacionada con mutaciones puntuales en el gen ATAD3C. Al mismo tiempo realizamos una comparativa entre su fenotipo y el del resto de casos publicados teniendo en cuenta los distintos tipos de mutaciones encontradas.<br /

Efecto de las variantes genéticas poblacionales del ADN mitocondrial en la susceptibilidad al cáncer

El microambiente que se produce en los tumores favorece la aparición de mutaciones en el ADN mitocondrial (mtADN). Algunas de estas mutaciones, que afectan al metabolismo energético, incrementarán la supervivencia de las células y serán positivamente seleccionadas. Estas mutaciones podrían contribuir a diferentes características de los tumores, como el remodelado de la matriz extracelular, los procesos angiogénicos y la aparición de metástasis. Del mismo modo que las mutaciones somáticas, aunque con efectos probablemente menos dramáticos, algunos polimorfismos poblacionales del mtADN afectarán la función del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS), el metabolismo y la homeostasis celular, comportándose como factores heredados de susceptibilidad al cáncer. A pesar de que se han acumulado numerosas evidencias epidemiológicas que relacionan variantes genéticas del mtADN con el cáncer, es necesaria la aportación de pruebas más directas. Por ello, el modelo de líneas celulares transmitocondriales, híbridos citoplasmáticos o cíbridos puede ayudar a consolidar este campo de investigación

Patogenicidad de variantes genéticas nucleares con implicación en el metabolismo del RNA mitocondrial

Las enfermedades mitocondriales son un conjunto de desórdenes metabólicos y genéticos en que, sobre todo, se encuentra comprometida la fosforilación oxidativa de las mitocondrias. Además, se caracterizan por ser enfermedades muy heterogéneas desde un punto de vista clínico y genético, influyendo en esto último el hecho de que su etiología puede residir en variantes que ocurran tanto en el mtDNA como en el nDNA. La interpretación de la patogenicidad de una variante genética es un proceso complejo que requiere de la integración de los datos clínicos, análisis bioinformáticos y estudios moleculares. En la presente tesis doctoral se han analizado los fibroblastos de dos pacientes con variantes en genes nucleares que codifican para proteínas mitocondriales: un primer paciente con un cuadro clínico característico de una enfermedad mitocondrial y con las variantes p.A507S (cambio de sentido) y p.K562* (sin sentido) en PNPT1, encontradas en heterocigosis compuesta; un segundo paciente con una clínica que se aleja de la neuromuscular más característica de las enfermedades mitocondriales (presenta, sobre todo, una alteración del metabolismo serotoninérgico) y con la variante de novo p.Q346* (sin sentido) en TEFM, detectada en heterocigosis. PNPT1 codifica para la PNPasa, proteína que actúa en forma de homotrímero y que, junto a la helicasa SUV3, constituye el degradosoma, principal complejo implicado en la degradación de los mtRNA. Los experimentos llevados a cabo en células del paciente con las variantes en este gen han permitido concluir que dichas mutaciones son patológicas y que constituyen la etiología genética de su enfermedad, ya que derivan en un déficit de la PNPasa que provoca, en última instancia, una disfuncionalidad del sistema OXPHOS. Además, se ha obtenido que la sobreexpresión de PNPT1 es perjudicial para los fibroblastos primarios, si bien en los inmortalizados puede ser capaz de revertir el fenotipo patológico, y que una alteración en los niveles transcripcionales o proteicos de la PNPasa deriva en una regulación de dichos niveles de la helicasa SUV3. Finalmente, los resultados obtenidos han motivado la propuesta de un modelo por el que la PNPasa se encuentra localizada en la matriz mitocondrial, pero con la posibilidad de que pueda estar tanto en forma soluble como anclada por su N-terminal a la membrana interna de las mitocondrias. TEFM codifica para la proteína homónima, cuya principal función descrita hasta la fecha es la de elongar la transcripción mitocondrial mediante diversos mecanismos con los que apoya a POLRMT en su función, entre los que destacan el aumento de la procesividad de la RNA polimerasa y una función anti-terminadora de la transcripción en CSBII. Los ensayos realizados en células del paciente con la variante en este gen han llevado a concluir que ésta provoca una alteración de la fosforilación oxidativa y abren las puertas a la implicación de TEFM en los mecanismos que relacionan al sistema OXPHOS con los niveles de la serotonina. Además, se ha obtenido que la sobreexpresión de TEFM es tóxica para los fibroblastos, ya que produce una afectación generalizada de todos los parámetros evaluados. Entre ellos, destaca un descenso drástico de la proteína TFAM, unos primers R-loop de tamaño insuficiente para desempeñar su función en el inicio de la replicación y una gran afectación del sistema OXPHOS. Todos estos resultados, junto a los del propio paciente, especialmente al someter a los modelos celulares de estudio a estrés con EtBr, así como los publicados por otros autores, llevan a establecer que la función de TEFM es más compleja que la descrita hasta el momento y que se encuentra condicionada por sus niveles: actúa como un sensor que regula el metabolismo del mtDNA y mtRNA.<br /

Caracterización del gen MAPT en modelos celulares para el estudio de la enfermedad de Alzheimer

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por la presencia de placas seniles y ovillos neurofibrilares en el cerebro, formados por depósitos del péptido β-amiloide y la proteína tau hiperfosforilada, respectivamente. El origen de la enfermedad y las bases moleculares de la misma siguen en estudio, ámbito en el que desde nuestro grupo se ha establecido una hipótesis que relaciona al sistema OXPHOS, la síntesis de novo de pirimidinas y la EA. Para comprobar esta hipótesis es necesario investigar las bases moleculares de la enfermedad y para ello deben validarse modelos de estudio de forma previa. En el presente trabajo se ha llevado a cabo la validación de las líneas celulares hNSC, SH-SY5Y y SK-N-BE(2)-C como modelos adecuados a fin de diferenciarlas a neuronas colinérgicas y estudiar la proteína tau en ensayos posteriores. En concreto, se ha realizado la caracterización del gen MAPT (Microtubule-associated protein tau), codificante para la proteína tau, mediante el análisis de la expresión del gen y del ratio del grupo de isoformas 3R y 4R (establecidas por splicing alternativo del exón 10), así como la búsqueda de las 6 isoformas mayoritarias presentes en cerebro adulto humano y el estudio de las variaciones genéticas de MAPT. En las líneas SK-N-BE(2)-C y SH-SY5Y no se han encontrado variaciones en los transcritos secuenciados de MAPT y se ha observado un claro predominio de la isoforma fetal con respecto a las demás. Sin embargo, más ensayos son necesarios para validar la línea hNSC antes de su utilización, ya que sólo ha podido determinarse la mayor expresión de las isoformas 3R en esta línea celular