Mécanismes d'action de deux analogues de purines, la 2-chloroadénosine et la 2-chloro-2'-désoxyadénosine, dans des modèles de la leucémie lymphoïde chronique

Les analogues de nucléosides sont de petites molécules cytotoxiques chimiquement similaires aux nucléosides physiologiques, utilisées dans le traitement d’hémopathies malignes et de certaines tumeurs solides. Deux analogues puriques, la 2-chloroadénosine (2-CAdo), toujours à l’étude fondamentale, et la 2-chloro-2’-désoxyadénosine (CdA), utilisée en clinique, ont fait principalement l’objet de cette thèse. La 2-CAdo est un analogue de l’adénosine utilisé initialement comme agoniste des récepteurs de l’adénosine. Cette molécule est capable d’induire l’apoptose via l’activation des récepteurs de l’adénosine ou via son métabolisme intracellulaire. Cependant, les mécanismes d’induction de l’apoptose n’étaient pas bien connus. La première partie de cette thèse a été consacrée à l’étude de ces mécanismes dans un modèle de leucémie lymphoïde chronique (LLC), la lignée cellulaire EHEB. Nous avons d’abord confirmé, par plusieurs approches, que la 2-CAdo induit effectivement l’apoptose dans ces cellules leucémiques et que celle-ci résulte de son métabolisme. En effet, l’inhibition de la conversion intracellulaire de la 2-CAdo en son dérivé triphosphate, le 2-CATP, supprime sa cytotoxicité. L’accumulation de 2-CATP est accompagnée d’une chute de l’ATP intracellulaire, d’une inhibition de la synthèse d’ADN, d’ARN et des protéines, ainsi que d’une libération de cytochrome c dans le cytosol, indiquant que la 2-CAdo active la voie intrinsèque de l’apoptose. L’activation de cette voie ne fait pas intervenir le facteur de transcription p53, mais a pu être corrélée à une diminution du taux de Mcl-1, une protéine anti-apoptotique, à courte demi-vie. Enfin, il est apparu que la chute d’ATP qui accompagne la métabolisation de la 2-CAdo joue un rôle important dans le processus apoptotique déclenché par cet analogue de nucléoside. Dans la seconde partie de cette thèse, nous nous sommes intéressés à la CdA, un analogue de la 2’-désoxyadénosine. La CdA, après sa conversion en composé triphosphate, le CdATP, s’incorpore dans l’ADN, y crée des lésions et active le facteur de transcription p53, ce qui active la voie intrinsèque de l’apoptose. L’activation de p53 est habituellement suivie d’une inhibition du cycle cellulaire suite à l’augmentation de l’expression de p21, une protéine qui inhibe la Cdk2 (cyclin dependent kinase 2), une kinase qui joue un rôle clé dans le déroulement du cycle cellulaire. Comme des travaux précédents menés au laboratoire avaient montré que la CdA n’induisait pas d’arrêt du cycle cellulaire dans les cellules EHEB, mais produisait au contraire une accélération de la transition G1/S, nous avons décidé d’analyser en détail l’axe p53/p21 de ces cellules. Nous avons pu montrer que la CdA, mais aussi la fludarabine, la gemcitabine et la cytarabine, provoquent dans les cellules EHEB et dans les cellules JVM-2, un autre modèle de LLC, une déplétion de p21. Celle-ci se produit malgré l’activation de p53 et l’augmentation de l’ARNm de p21, indiquant qu’elle résulte d’une augmentation de sa dégradation. De fait, nous avons pu montrer que les analogues de nucléosides provoquent dans les lignées LLC une augmentation de la dégradation de p21 par le protéasome, par une voie qui serait indépendante de l’ubiquitine. Finalement, il s’est avéré que ces analogues de nucléosides induisent dans les deux lignées EHEB et JVM-2 une augmentation de l’activité de la Cdk2 et une monoubiquitination de PCNA, deux processus régulés négativement par p21. Ces changements n’ont pas été observés avec d’autres activateurs de p53, comme l’étoposide et la nutline-3a qui augmentent le taux de p21.(SBIM 3) -- UCL, 201

Mechanisms of cell death induced by 2-chloroadenosine in leukemic B-cells

2-chloroadenosine (2-CAdo) is an adenosine deaminase-resistant analogue of adenosine, widely used as an adenosine receptor agonist. This compound has been shown to induce apoptosis in several cell types either via activation of adenosine receptors or via intracellular metabolism. However, the molecular mechanisms of 2-CAdo-induced apoptosis are unclear. Here, we analyzed the effects of 2-CAdo in the leukemia cell line EHEB. 2-CAdo was found to induce apoptosis in EHEB cells, as shown by caspase-3 activation, DNA fragmentation, poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) cleavage and phosphatidylserine exposure. Cytotoxicity of 2-CAdo was completely suppressed by 5-iodotubercidin, an adenosine kinase inhibitor, indicating that apoptosis induced by 2-CAdo was the result of its intracellular metabolism. Accordingly, we found that 2-CAdo was efficiently converted into 2-chloroATP. In parallel, a decrease of intracellular ATP concentration as well as a general inhibition of macromolecular synthesis, involving DNA, RNA and protein synthesis, was observed. Moreover, 2-CAdo induced cytochrome c release into the cytosol, indicating activation of the intrinsic pathway of apoptosis. This was found associated with a decline in Mcl-1 protein level and p53-independent. Inhibition of AMP deaminase by coformycin markedly prevented ATP depletion, and also significantly reduced 2-CAdo cytotoxicity and caspase-3 activation. In conclusion, our data show that intracellular metabolism of 2-CAdo can lead to activation of the intrinsic pathway of apoptosis and that ATP depletion, in addition to the accumulation of the triphosphate analogue, contributes to 2-CAdo-induced apoptosis

Overexpression of AMP-metabolizing enzymes controls adenine nucleotide levels and AMPK activation in HEK293T cells.

We investigated whether overexpression of AMP-metabolizing enzymes in intact cells would modulate oligomycin-induced AMPK activation. Human embryonic kidney (HEK) 293T cells were transiently transfected with increasing amounts of plasmid vectors to obtain a graded increase in overexpression of AMP-deaminase (AMPD) 1, AMPD2, and soluble 5'-nucleotidase IA (cN-IA) for measurements of AMPK activation and total intracellular adenine nucleotide levels induced by oligomycin treatment. Overexpression of AMPD1 and AMPD2 slightly decreased AMP levels and oligomycin-induced AMPK activation. Increased overexpression of cN-IA led to reductions in the oligomycin-induced increases in AMP and ADP concentrations by ∼70 and 50%, respectively, concomitant with a 50% decrease in AMPK activation. The results support the view that a rise in ADP as well as AMP is important for activation of AMPK, which can thus be regulated by the adenylate energy charge. The control coefficient of cN-IA on AMP was 0.3-0.7, whereas the values for AMPD1 and AMPD2 were <0.1, suggesting that in this model cN-IA exerts a large proportion of control over intracellular AMP. Therefore, small molecule inhibition of cN-IA could be a strategy for AMPK activation

Nucleoside analogs induce proteasomal down-regulation of p21 in chronic lymphocytic leukemia cell lines

Nucleoside analogs (NAs) represent an important class of anticancer agents that induce cell death after conversion to triphosphate derivatives. One of their most important mechanisms of action is the activation of p53, leading to apoptosis through the intrinsic pathway. Classically, the activation of p53 also induces p21 accumulation, which leads to cell cycle arrest at the G1/S transition. In previous work, we observed that 2-chloro-2'-deoxyadenosine (CdA), a NA with high activity in lymphoid disorders, including chronic lymphocytic leukemia (CLL), promotes the G1/S transition in the CLL cell line EHEB at cytotoxic concentrations. This finding led us to investigate the p21 response to NAs in these cells. We show here that CdA, but also fludarabine, gemcitabine, and cytarabine, strongly reduced the p21 protein level in EHEB cells as well as in JVM-2 cells, another CLL cell line. This p21 depletion occurred despite induction of p53 and increase of p21 mRNA and was prevented by proteasome inhibitors. Increase of proteasomal degradation caused by NAs appeared to be ubiquitin-independent. Also, NAs induced in these cells an increase of cyclin-dependent kinase (Cdk2) activity and a monoubiquitination of cell proliferating nuclear antigen (PCNA), two processes that are negatively regulated by p21. These changes were not observed with other p53 activators, like etoposide and nutlin-3a that increased the p21 protein level. In conclusion, our study reveals that NAs can induce an alternative pattern of cellular response in some cell models