Insertion hot spot for horizontally acquired DNA within a bidirectional small-RNA locus in Salmonella enterica

In Escherichia coli and Salmonella enterica, RyeA and RyeB RNAs are encoded on opposite DNA strands at the same locus. We present evidence indicating that the last 23 bp of the ryeB gene, corresponding to an internal portion of the ryeA gene, served repeatedly as the integration site for exogenous DNA during Salmonella evolution and still act as an attachment site for present-day bacteriophages. Interestingly, ryeA sequence and expression are modified upon lysogenization.Ministerio de Educación y Ciencia BIO2004-3455-CO2-0

Análisis Genético y Molecular de ARNs pequeños reguladores en Salmonella enterica

En bacterias, los ARN no codificantes reguladores o "ARNs pequeños" (sRNA) regulan la expresión de genes-diana interaccionando con la región 5’ no traducida del ARN mensajero y facilitando o dificultando el acceso del ribosoma y/o la degrad ... En bacterias gram-negativas, condiciones que afectan al plegamiento de proteínas de la membrana externa (OMPs) activan el factor sigma alternativo σE, responsable de la transcripción de un conjunto de genes cuyos productos confieren tolerancia a dichas condiciones. En los estudios realizados durante esta tesis, se describió la activación constitutiva de la respuesta mediada por σE en ausencia de Hfq. La proteína Hfq es una “chaperona de ARNs” esencial para la estabilidad y función de la inmensa mayoría de sRNAs. Los experimentos realizados durante esta tesis definieron que la inducción de la respuesta σE se debe a la estimulación de la degradación de un factor anti-σE llamado RseA, que en condiciones normales secuestra a σE, impidiendo su acción. Se describió que la degradación de RseA está relacionada con la pérdida de la represión de varias OMPs por parte de dos sRNAs pertenecientes al regulón σE: MicA y RybB.MicA reprime la traducción de las proteínas de la membrana externa OmpA y LamB. Por su parte, RybB inhibe la síntesis de varias proteínas de la membrana externa, reprimiendo la traducción y/o estimulando la degradación de los correspondientes ARNs mensajeros. Dos de los ARNm-diana son el de ompC y el de ompD. Con el objeto de identificar las secuencias determinantes en la interacción RybB:ompC, obtuvimos mutantes alterados en dicha interacción gracias a un procedimiento que combina la PCR mutagénica con la recombinación mediada por el sistema lambda Red. Fragmentos de ADN que contenían el gen rybB o la región situada corriente abajo del promotor de ompC fueron amplificados en condiciones propensas a error y transferidos al cromosoma de una estirpe que porta una fusión ompC::lacZ y expresa constitutivamente σE. Los mutantes se detectaron por cambios de color en placas indicadoras. De este modo se obtuvo una colección de mutantes, posteriormente ratificados por secuenciación y caracterizados por Northern. Esta estrategia ha permitido identificar las secuencias de ARN implicadas en la interacción RybB:ompC, así como las relacionadas con la estabilidad de RybB y la interacción con la proteína Hfq. Analizando los efectos de los mutantes en RybB sobre ompD, se ha descrito el primer ejemplo de interacción pequeño ARN:ARNm en dos localizaciones diferentes, con la particularidad adicional de que dichas interacciones tienen lugar dentro de la secuencia codificante del gen. Además, se ha descrito un nuevo gen perteneciente al regulón RybB: la quitoporina ChiP. Durante esta tesis también se estudió la posible participación de los sRNA en procesos biológicos más allá de la regulación de la expresión génica. Se definió la existencia de un locus, en el que están codificados dos sRNAs (ryeA y ryeB), que ha resultado un punto preferente de inserción de profagos bacterianos. Además, se describió que dicha inserción tenía efecto sobre los niveles de expresión relativa de ambos sRNAs, invirtiéndola, y sugiriendo unas consecuencias biológicas aún por estudiar. En cualquier caso, la clara implicación de los profagos, en tanto que elementos genómicos móviles, en procesos de transferencia genética horizontal, convierte a los sRNAs en principales participantes del proceso de evolución bacteriana. El conjunto de estudios realizados ha subrayado la enorme utilidad de la genética clásica en el estudio de la regulación mediada por pequeños ARN no codificantes, y ha supuesto el esclarecimiento de eventos clave en dichos procesos

Recombineering 101: Making an in-Frame Deletion Mutant

DNA recombineering uses phage λ Red recombination functions to promote integration of DNA fragments generated by polymerase chain reaction (PCR) into the bacterial chromosome. The PCR primers are designed to have the last 18-22 nt anneal on either side of the donor DNA and to carry 40- to 50-nt 5' extensions homologous to the sequences flanking the chosen insertion site. The simplest application of the method results in knockout mutants of nonessential genes. Deletions can be constructed by replacing a portion or the entirety of a target gene with an antibiotic-resistance cassette. In some commonly used template plasmids, the antibiotic-resistance gene can be coamplified with a pair of flanking FRT (Flp recombinase recognition target) sites that, following insertion of the fragment into the chromosome, allow excision of the antibiotic-resistance cassette via the activity of the site-specific Flp recombinase. The excision step leaves behind a "scar" sequence comprising an FRT site and flanking primer annealing sequences. Removal of the cassette minimizes undesired perturbations on the expression of neighboring genes. Even so, polarity effects can result from the occurrence of stop codons within, or downstream of, the scar sequence. These problems can be avoided by the appropriate choice of the template and by designing primers so that the reading frame of the target gene is maintained past the deletion end point. This protocol is optimized for use with Salmonella enterica and Escherichia coli.Agence Nationale de la Recherche ANR-15-CE11-0024-0

Salmonella Type III Secretion Effector SrfJ: A Glucosylceramidase Affecting the Lipidome and the Transcriptome of Mammalian Host Cells

Type III secretion systems are found in many Gram-negative pathogens and symbionts of animals and plants. Salmonella enterica has two type III secretion systems associated with virulence, one involved in the invasion of host cells and another involved in maintaining an appropriate intracellular niche. SrfJ is an effector of the second type III secretion system. In this study, we explored the biochemical function of SrfJ and the consequences for mammalian host cells of the expression of this S. enterica effector. Our experiments suggest that SrfJ is a glucosylceramidase that alters the lipidome and the transcriptome of host cells, both when expressed alone in epithelial cells and when translocated into macrophages in the context of Salmonella infection. We were able to identify seventeen lipids with higher levels and six lipids with lower levels in the presence of SrfJ. Analysis of the forty-five genes, the expression of which is significantly altered by SrfJ with a fold-change threshold of two, suggests that this effector may be involved in protecting Salmonella from host immune defenses.Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) de la Unión Europea, y Departament de Recerca i Universitats de la Generalitat de Catalunya - IU16-01580