Modulation de l'activité du flavocytochrome b (étude fonctionnelle)

Le complexe NADPH oxydase est un élément essentiel de l immunité inné. Présent dans les cellules phagocytaires (neutrophile), sa fonction est de produire massivement, dans le phagosome, des anions superoxyde et générer ainsi des espèces encore plus réactives de l oxygène qui vont détruire acides nucléiques, lipides et protéines des bactéries phagocytées. Le cœur membranaire catalytique du complexe NADPH oxydase est constitué d un hétérodimère membranaire, le cytochrome b (Cyt b ). Après activation de celui-ci par les partenaires protéiques cytosoliques p47phox, p67phox, p40phox et Rac, une succession de réactions de transferts d électron de part et d autre de la membrane a lieu au sein du Cyt b pour aboutir à la réduction du dioxygène de manière très contrôlée. Afin de mieux comprendre cette régulation, nous nous sommes d abord intéressés aux stéreoisomères trans de l acide arachidonique, activateur naturel de cet enzyme (cis), sur le fonctionnement de la NADPH oxydase et avons abordé cette étude parallèlement sur du Cytb d origine bovine présent dans des membranes de neutrophiles et dans des membranes de levures exprimant le Cytb de manière hétérologue. Nous avons montré que la géométrie joue un rôle important sur l activation du complexe enzymatique. Dans un deuxième temps, afin d étudier le rôle de l environnement membranaire sur le fonctionnement de la NADPH oxydase, nous avons déterminé les propriétés cinétiques et thermodynamiques de l activité NADPH oxydase du Cytb recombinant exprimé en levures, purifié, puis reconstitué en liposomes de composition lipidique variée. Après comparaison avec ces mêmes propriétés obtenues pour le Cytb dans les membranes plasmiques et du réticulum endoplasmique de levures, nous avons montré que l activité NADPH oxydase très sensible à la température peut être modulée par la composition et l état physique de la membrane.NADPH oxidase complex is a major actor of both antimicrobial host defense and inflammation by generating highly regulated superoxide anion, rapidly converted into reactive oxygen species (ROS). The NADPH oxidase complex consists of a heterodimeric integral membrane flavocytochrome b and three cytosolic components p67phox, p47phox and p40phox, and the small GTP binding protein Rac. In response to a cellular stimulus, cytosolic proteins are recruited to the phagosomal membrane where they are assembled with the Cytb to form the active NADPH oxidase. The aim of the work was to better understand the modulation of superoxide anion production by this enzyme. For this purpose, we performed experiments with both bovine neutrophil membranes and yeast membranes expressing the bovine recombinant Cytb . We first investigated the effect of the trans-isomerization of the cis-arachidonic acid, the activator of NADPH oxidase in vitro and showed that specific geometry of the activator plays an important role in the activation of the complex. We also studied the role of the membrane environment on the functioning of NADPH oxidase and determined the kinetics and thermodynamics of NADPH oxidase activity depending on the lipid composition of Cytb proteoliposomes. Comparison with these properties obtained with recombinant Cytb embedded into endoplasmic reticulum and plasma membranes, we showed that the NADPH oxidase activity is highly temperature dependent and can be modulated by the lipid environment and the physic state of the membrane.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

PolDIP2, une protéine clé de la régulation du fonctionnement mitochondrial et du métabolisme cellulaire

Pour la sixième année, dans le cadre du module d’enseignement « Physiopathologie de la signalisation » proposé par l’université Paris-sud, les étudiants du Master « Biologie Santé » de l’université Paris-Saclay se sont confrontés à l’écriture scientifique. Ils ont sélectionné une quinzaine d’articles scientifiques récents dans le domaine de la signalisation cellulaire présentant des résultats originaux, via des approches expérimentales variées, sur des thèmes allant des relations hôte-pathogène aux innovations thérapeutiques, en passant par la signalisation hépatique et le métabolisme. Après un travail préparatoire réalisé avec l’équipe pédagogique, les étudiants, organisés en binômes, ont ensuite rédigé, guidés par des chercheurs, une Nouvelle soulignant les résultats majeurs et l’originalité de l’article étudié. Ils ont beaucoup apprécié cette initiation à l’écriture d’articles scientifiques et, comme vous pourrez le lire, se sont investis dans ce travail avec enthousiasme ! Trois de ces Nouvelles sont publiées dans ce numéro, les autres le seront dans des prochains numéros

The cytosolic subunit p67phox of the NADPH-oxidase complex does not bind NADPH.

International audienceThe NADPH-oxidase of phagocytic cells is a multicomponent enzyme that generates superoxide. It comprises a membrane flavocytochrome b558 and four cytosolic proteins; p67phox, p47phox, p40phox and Rac. The NADPH-binding site of this complex was shown to be located on the flavocytochrome b558. However, a number of studies have suggested the presence of another site on the p67phox subunit which is the key activating component. Using several approaches like tryptophan quenching fluorescence measurement, inhibition by 2',3'-dialdehyde NADPH, and free/bound NADPH concentration measurements, we demonstrate that no NADPH binds on p67phox, thus definitively solving the controversy on the number and location of the NADPH-binding sites on this complex