Influence of hyaluronic acid on bacterial and fungal species, including clinically relevant opportunistic pathogens.

Hyaluronic acid (HA) has several clinical applications (aesthetic surgery, dermatology, orthopaedics and ophtalmology). Following recent evidence, suggesting antimicrobial and antiviral properties for HA, we investigated its effects on 15 ATCC strains, representative ofclinically relevant bacterial and fungal species. The in vitro system employed allowed to assess optical density of broth cultures as a measure of microbial load in a time-dependent manner. The results showed that different microbial species and, sometimes, different strains belonging to the same species, are differently affected by HA. In particular, staphylococci, enterococci, Streptococcus mutans, twoEscherichia coli strains, Pseudomonas aeruginosa, Candida glabrata and C. parapsilosis displayed a HA dosedependent growth inhibition; no HA effects were detected in E. coli ATCC 13768 and C. albicans; S. sanguinis was favoured by the highest HA dose. Therefore, the influence of HA on bacteria and fungi warrants further studies aimedat better establishing its relevance in clinical applications

Impact of soluble tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand released by engineered adipose mesenchymal stromal cells on white blood cells

Background aims: The proapoptotic protein tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is physiologically expressed by immune cells and performs regulatory functions in infections, autoimmune diseases and cancer, where it acts as a tumor suppressor. Adipose-derived mesenchymal stromal cells (AD-MSCs) also may play immunomodulatory roles in both primary and acquired immune responses. We have previously demonstrated the efficacy of an anticancer gene therapy based on AD-MSC engineered to secrete a soluble TRAIL variant (sTRAIL) against pancreatic cancer. However, the impact of AD-MSC sTRAIL on leukocyte subsets has been not yet considered also to predict a possible immunotoxicity profile in the clinical translation of this cell-based anticancer strategy. Methods: Monocytes, polymorphonuclear cells and T lymphocytes were freshly isolated from the peripheral blood of healthy donors. Immunophenotype and functional (DR4 and DR5) and decoy (DcR1 and DcR2) TRAIL receptors were tested by flow cytometry. The viability of white blood cells treated with sTRAIL released by gene-modified AD-MSC or co-cultured with AD-MSC sTRAIL was then evaluated by both metabolic assays and flow cytometry. In addition, cytokine profile in co-cultures was analyzed by multiplex enzyme-linked immunosorbent assay. Results: Monocytes and polymorphonuclear cells showed high positivity for DR5 and DcR2, respectively, whereas T cells revealed negligible expression of all TRAIL receptors. Irrespective of TRAIL receptors' presence on the cell membrane, white blood cells were refractory to the proapoptotic effect displayed by sTRAIL secreted by gene-modified AD-MSC, and direct cell-to-cell contact with AD-MSC sTRAIL had negligible impact on T-cell and monocyte viability. Cytokine crosstalk involving interleukin 10, tumor necrosis factor alpha, and interferon gamma secreted by T lymphocytes and vascular endothelial growth factor A and interleukin 6 released by AD-MSC was highlighted in T-cell and AD-MSC sTRAIL co-cultures. Conclusions: In summary, this study demonstrates the immunological safety and thus the clinical feasibility of an anticancer approach based on AD-MSC expressing the proapoptotic molecule sTRAIL.Background aims: The proapoptotic protein tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is physiologically expressed by immune cells and performs regulatory functions in infections, autoimmune diseases and cancer, where it acts as a tumor suppressor. Adipose-derived mesenchymal stromal cells (AD-MSCs) also may play immunomodulatory roles in both primary and acquired immune responses. We have previously demonstrated the efficacy of an anticancer gene therapy based on AD-MSC engineered to secrete a soluble TRAIL variant (sTRAIL) against pancreatic cancer. However, the impact of AD-MSC sTRAIL on leukocyte subsets has been not yet considered also to predict a possible immunotoxicity profile in the clinical translation of this cell-based anticancer strategy. Methods: Monocytes, polymorphonuclear cells and T lymphocytes were freshly isolated from the peripheral blood of healthy donors. Immunophenotype and functional (DR4 and DR5) and decoy (DcR1 and DcR2) TRAIL receptors were tested by flow cytometry. The viability of white blood cells treated with sTRAIL released by gene-modified AD-MSC or co-cultured with AD-MSC sTRAIL was then evaluated by both metabolic assays and flow cytometry. In addition, cytokine profile in co-cultures was analyzed by multiplex enzyme-linked immunosorbent assay.Results: Monocytes and polymorphonuclear cells showed high positivity for DR5 and DcR2, respectively, whereas T cells revealed negligible expression of all TRAIL receptors. Irrespective of TRAIL receptors' pres-ence on the cell membrane, white blood cells were refractory to the proapoptotic effect displayed by sTRAIL secreted by gene-modified AD-MSC, and direct cell-to-cell contact with AD-MSC sTRAIL had negligible impact on T-cell and monocyte viability. Cytokine crosstalk involving interleukin 10, tumor necrosis factor alpha, and interferon gamma secreted by T lymphocytes and vascular endothelial growth factor A and inter-leukin 6 released by AD-MSC was highlighted in T-cell and AD-MSC sTRAIL co-cultures. Conclusions: In summary, this study demonstrates the immunological safety and thus the clinical feasibility of an anticancer approach based on AD-MSC expressing the proapoptotic molecule sTRAIL.(c) 2023 International Society for Cell & Gene Therapy. Published by Elsevier Inc. This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/

Differential gene expression patterns in HER2 positive metastatic breast cancer patients according to hormone receptor status

Background: HER2 positive breast cancer (HER2+ BC) is a heterogeneous disease. Presenting features, patterns of recurrence and survival of HER2+ BC can differ according to hormone receptors (HR) status. The purpose of this study is to highlight different gene profiles and molecular pathways between HR+ and HR- metastatic HER2+ BCs. Material and Methods: 34 HER2+ metastatic BC patients were included: 18 patients with HR+/HER2+ and 14 with HR-/HER2+. Data regarding tumor characteristics, treatment information and clinical outcomes were collected. The expression of 770 genes and 13 molecular pathways were evaluated by means of Nanostring PanCancer pathway panel performed on BC formalin-fixed paraffin-embedded tissues from diagnostic core biopsy or surgical resection. Results: Gene expression analysis identified 118 genes with significantly different expression in the two cohorts. All but one of these genes were over-expressed; only the gene CACNG6 was down-regulated in HR+/HER2+ group. In particular, 93 genes were over-expressed in HR-/HER2+ while 24 were overexpressed in HR+/HER2+. Most of these genes encoded growth factors, pro- or anti-inflammatory interleukins and DNA repair factors. 62% of these genes were involved in PI3K, MAPK and RAS pathways (32, 22 and 18, respectively). PI3K, MAPK and NOTCH pathways were differently expressed between HR+/HER2+ and HR-/HER2+ (p=0.003, p=0.0018, p=0.02, respectively). All these three pathways were overexpressed in HR-/HER2+ BC. In particular, all the significantly different expression genes in NOTCH pathways were overexpressed in HR-/HER2+ group. Conclusions: This genome expression analysis identified a gene expression profile able to differentiate HR+ versus HR- HER2+ metastatic BC. The overexpression of PI3K, MAPK and NOTCH pathways in HR-/HER2+ BC could justify its more aggressive behaviour. The validation of this HER2+ BC profile needs further investigation. Keywords: metastatic breast cancer, gene expression profile, HER2 positive breast cancer, PanCance

I MICROARRAY PROTEICI: POSSIBILI SCENARI NELLA DIAGNOSTICA DELLE MICOSI INVASIVE

I microarray proteici sono comunemente distinguibili in due tipi, uno dedicato a stabilire la presenza e la quantità di una proteina o di un anticorpo specifico presenti in una determinata matrice biologica (“abundance-based microarrays”) e l’altro a valutarne la funzione (“function-based microarrays”) (1). Per quanto attiene alla prima categoria, sono stati descritti sistemi a cattura molto simili a quelli utilizzati nei saggi ELISA che prevedono l’immobilizzazione su un supporto solido di molecole di cattura. Tali molecole possono essere anticorpi, soprattutto monoclonali, per la rilevazione quali-quantitativa di analiti specifici, oppure antigeni purificati/ricombinati per la determinazione di specifici titoli anticorpali. Ad oggi, questo tipo di microarray ha trovato un grosso impiego nel campo della proteomica, nella ricerca di nuovi farmaci e nella identificazione di marcatori di malattia, principalmente nell’ambito delle infezioni virali e dei tumori. Le caratteristiche dei saggi diagnostici su piattaforma microarray, quali l’elevata sensibilità, la multiparametricità, la miniaturizzazione e la possibilità di automazione, hanno portato alla messa a punto di piattaforme innovative, particolarmente utili anche per la loro duttilità. L’utilizzo dei microarray proteici in diagnostica ha portato inoltre a riconsiderare la sierologia come strumento di indagine potenzialmente utile nella diagnosi di micosi opportunistiche invasive e nella valutazione dell’efficacia di terapie antifungine. In un lavoro recentemente pubblicato, è stato identificato un gruppo di 13 antigeni di Candida albicans che consente di discriminare pazienti con candidemia, da soggetti sani o colonizzati; sempre gli stessi autori hanno descritto un altro gruppo di 33 antigeni, che permette di distinguere sierologicamente pazienti in fase acuta di malattia da pazienti convalescenti (2). Dall’altra parte, nella diagnosi di micosi primitive da patogeni quali Histoplasma capsulatum e Coccidioides immitis, in cui la sierologia riveste un ruolo di primo piano, l’impiego del microarray proteico ha portato ad accorpare in un unico chip antigeni dei diversi patogeni (3). In particolare, il saggio messo a punto consente di identificare simultaneamente soggetti positivi per uno o più patogeni, sulla base dei livelli di IgM e/o IgG specifiche. Similmente, sono stati riconosciuti come marcatori di polmonite gli alti livelli di anticorpi sierici verso la proteina Msg1 di Pneumocystis jirovecii (4), mentre la comparsa di citochine proinfiammatorie e della proteina C-reattiva sono risultate preziosi marcatori sierologici precoci di aspergillosi invasiva (5). Nel complesso, visto l’incremento nel numero sia di micosi opportunistiche in soggetti particolarmente difficili sia di micosi primitive (in passato inusuali, ora più frequenti dato l’aumento dei flussi turistici e migratori), i contributi forniti dalle nuove tecnologie saranno fondamentali per comprendere meglio il quadro clinico associato alla micosi invasiva, grazie ad un metodo diagnostico veloce e multiparametrico. Questo aspetto risulterà particolarmente interessante in quanto consentirà di valutare contemporaneamente tipi diversi di parametri che includono non solo il patogeno ed i suoi prodotti, ma anche l’ospite con la sua peculiare reattività antimicrobica, sia innata che adattativa. (1) LaBaer and Ramachandran, Curr Opin Chem Biol, 2005 (2) Mochon et al., Plos Pathogens, 2010 (3) Ardizzoni et al., New Microbiol, 2011 (4) Djawe et al., Plos One, 2010 (5) Chai et al., J. Infect Dis, 201

I MICROARRAY PROTEICI: NUOVI STRUMENTI DI INDAGINE NELLA DIAGNOSTICA DELLE INFEZIONI DA PATOGENI DEL COMPLESSO TORCH.

Lo screening sierologico su larga scala, effettuato prima o durante la gravidanza, fornisce un mezzo efficace per prevenire le infezioni a trasmissione verticale (ITV) e le loro gravi conseguenze per il prodotto del concepimento. Utilizzando un microarray proteico da noi messo a punto (1), abbiamo voluto determinare i livelli di anticorpi antigene-specifici nei confronti di patogeni a trasmissione verticale nel siero, nei liquidi follicolari (LF) e nei liquidi amniotici (LA) di pazienti gravide sottoposte a IVF, al fine di correlare profili anticorpali specifici con l’esito della gravidanza. Sieri e LF sono stati prelevati da 102 pazienti sottoposte a trattamenti di procreazione medicalmente assistita. LA sono stati ottenuti da 100 pazienti di cui 50 con parto pretermine e 50 con parto a termine. I microarray, allestiti con antigeni, anticorpi e controlli di segnale, come precedentemente descritto (1), sono stati processati con siero, LF o LA e la formazione degli immunocomplessi è stata rivelata mediante anticorpi secondari marcati in fluorescenza. I segnali sono stati letti con uno scanner contenente laser a differenti lunghezze d’onda e successivamente quantificati ed analizzati da un software dedicato. Il saggio ha consentito di rivelare in maniera efficace IgG antigene-specifiche in tutte le matrici saggiate, mentre anticorpi IgM sono stati rilevati solamente nel siero. In particolare, la presenza o assenza di determinati anticorpi IgG nelle coppie di campioni siero/LF provenienti dalla stessa paziente è risultata significativamente correlata a parametri clinici, quali il numero di oociti inseminati di buona qualità o il numero di trasferimenti embrionali avvenuti con successo (2). L’analisi dei profili anticorpali sui LA nel secondo gruppo di 100 pazienti è tuttora in corso. Su questo gruppo di pazienti, inoltre, si sta impiegando un microarray commerciale per valutare la presenza di citochine e/o chemochine da correlare eventualmente con il quadro clinico della paziente e con l’esito della gravidanza (parto a termine o pretermine). Risultati preliminari hanno consentito di dimostrare l’efficacia dell’approccio, evidenziando la presenza di livelli significativi di alcune citochine nei fluidi amniotici. Sono in corso indagini per determinare il contenuto di citochine in tutti i LA oggetto di studio. I dati finora ottenuti sostengono fortemente l’utilizzo del microarray proteico in indagini ad ampio spettro nella diagnosi di ITV; inoltre, l’utilizzo di matrici biologiche differenti dal siero può fornire un valido contributo per la risoluzione di quesiti diagnostici ancora irrisolti. (1) Ardizzoni et al., Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2009. (2) Ardizzoni et al., J Reprod Immunol, 2011

VALUTAZIONE DEI PROFILI IgG E IgM NEI CONFRONTI DI PATOGENI A TRASMISSIONE VERTICALE IN DIVERSE MATRICI BIOLOGICHE MEDIANTE MICROARRAY PROTEICO

Lo screening sierologico su larga scala, effettuato prima o durante la gravidanza, fornisce un mezzo efficace per prevenire infezioni a trasmissione verticale (ITV) e le loro gravi conseguenze per il prodotto del concepimento. Utilizzando un microarray proteico da noi messo a punto (1), abbiamo voluto determinare i livelli di anticorpi antigene-specifici nei confronti di patogeni a trasmissione verticale nel siero, nei fluidi follicolari (FF) e nei fluidi amniotici (FA) di pazienti gravide, al fine di correlare profili anticorpali specifici con l’esito della gravidanza. Siero e FF sono stati prelevati da 102 pazienti sottoposte a trattamenti di procreazione medicalmente assistita. FA sono stati ottenuti da 100 pazienti di cui 50 con parto pretermine e 50 con gravidanza a termine. I microarray, allestiti con antigeni, anticorpi e controlli di segnale, come precedentemente descritto (1) sono stati processati con siero, FF o FA e la formazione degli immunocomplessi è stata rivelata mediante anticorpi secondari marcati in fluorescenza. I segnali sono stati letti con uno scanner contenente laser a differente lunghezza d’onda e successivamente quantificati ed analizzati da un software dedicato. Il saggio ha consentito di rivelare in maniera efficace anticorpi antigene-specifici in tutte le matrici saggiate. In particolare, la presenza o assenza di determinati anticorpi nelle coppie di campioni siero/FF provenienti dalla stessa paziente è risultata significativamente correlata a determinati parametri clinici, quali il numero di oociti inseminati di buona qualità o il numero di trasferimenti embrionali avvenuti con successo. L’analisi dei profili anticorpali sui FA del secondo gruppo di 100 pazienti è tuttora in corso. I dati ottenuti incoraggiano l’utilizzo del microarray proteico per indagini ad ampio spettro nella diagnosi di ITV; inoltre, l’utilizzo di matrici biologiche differenti dal siero può fornire un valido contributo per la risoluzione di problemi ancora aperti. (1) Ardizzoni et al., Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2009

DETECTION OF ANTIGEN-SPECIFIC ANTIBODIES IN SERUM AND FOLLICULAR FLUIDS BY PROTEIN MICROARRAYS.

Background. Wide spectrum serological screening of women prior to or during pregnancy may greatly help in preventing vertically transmitted infections (VTI) and their severe consequences to the foetus/newborn. Protein microarrays, made up by spotting many antigens onto a restricted area of a microscope slide, allow to detect, in one shot, specific antibodies against a wide range of antigenic specificities. Objectives. To detect, in paired serum and follicular fluid (FF) samples, antigen-specific antibodies against vertically transmitted pathogens by protein microarrays; to investigate the potential relation between antibody profiles and pregnancy outcome. Methods. Serum and FF paired samples were collected from 102 women undergoing in vitro fertilization (IVF). Antigens, human antibodies and controls were spotted in an orderly manner by high speed robotics. Microarrays were processed with serum or FF and the occurred immunocomplexes were revealed by fluorescently-labelled secondary antibodies. The fluorescent signals were read by a laser scanner and quantified by a dedicated software. Conclusions. Antigen-specific antibodies can be effectively detected in serum and FF by microarray. The presence or absence of certain antigen-specific antibodies is significantly related to clinical parameters such as the number of inseminated good quality oocytes or the number of successful embryo transfers. These results encourage protein microarrays employment for wide spectrum investigations in diagnosing VTI; in particular, the use of biological matrices other than serum may help addressing yet unravelled questions

IL MYCOARRAY: UN TEST RAPIDO PER LA DIAGNOSI SIEROLOGICA DI MICOSI ENDEMICHE

Introduzione Le micosi da funghi dimorfi, estremamente rare in Europa, sono rappresentate da casi di importazione, con l’eccezione della istoplasmosi per la quale sono stati segnalati anche casi autoctoni. La bassa frequenza, in combinazione con l’aspecificità delle manifestazioni cliniche, rende difficile una diagnosi rapida. Scopo del presente studio è la valutazione dell’utilizzo del saggio mycoarray (1) come strumento multiparametrico e rapido, a supporto della sierologia convenzionale, nella diagnosi di laboratorio delle micosi endemiche. Metodi Antigeni fungini (H. capsulatum, C. immitis, B. dermatitidis e P. brasiliensis), diluizioni scalari di anticorpi IgG e IgM e controlli sono stati deposti su vetrini microarray per mezzo di un sistema robotizzato ad alta precisione. I vetrini così ottenuti sono stati cimentati col siero, opportunamente diluito, e successivamente con anticorpi secondari marcati con fluorofori per rivelare l’avvenuta formazione degli immunocomplessi. Il segnale è stato acquisito mediante uno scanner, quantificato ed analizzato per mezzo di un apposito software. Risultati Il mycoarray ha mostrato elevate sensibilità e specificità: un primo studio retrospettivo, condotto su sieri da pazienti con diagnosi certa di istoplasmosi o di coccidioidomicosi, ha fornito risultati consistenti con i dati clinici e di laboratorio, acquisiti con la diagnostica di routine. Indagini su ulteriori campioni da casi clinici “sospetti”, analizzati con il mycoarray, hanno fornito risultati originali utili per la diagnosi definitiva di micosi endemica. Conclusioni Il mycoarray presenta una serie di peculiarità (miniaturizzazione, multiparametricità e rapidità di esecuzione) che lo rendono estremamente utile come strumento di laboratorio a sussidio del percorso convenzionale nella diagnosi di micosi primitive, specialmente in zone a bassa endemicità. Ringraziamenti Lavoro in parte supportato da MIUR, PRIN-200985J87J Bibliografia (1) Ardizzoni et al., (2011) New Microbiol, 34:307-16