Funktionelle Charakterisierung von AtCPK1 und AtCPK2 aus Arabidopsis thaliana unter Verwendung einer chemisch-genetischen Methode

Kalzium-abhängige Proteinkinasen (CDPKs) haben eine biologische Funktion in einer Reihe von zellulären Prozessen, was durch Überexpressionsanalysen und auf Kosuppression-basierten Silencing-Untersuchungen gezeigt werden konnte. Die Untersuchung von CDPK-Mutanten hat jedoch bisher, vermutlich aufgrund der hohen funktionellen Redundanz oder aufgrund von Anpassungsmechanismen der Pflanzen, zu keinen phänotypischen Auffällig¬keiten geführt. Ausschließlich im Falle von NtCDPK2 aus Tabak war es bislang möglich, die biologische Funktion einer einzelnen Isoform aufzuklären. In dieser Arbeit wurde eine chemisch-genetische Methode etabliert, die es ermöglicht, isoformspezifische Untersuchungen von CDPKs durchzuführen. Eine Mutation der ATP-Bindetasche verändert die Nukeotid¬binde¬eigen¬schaften von CDPKs daraufhin, dass sie durch den Kinaseinhibitor 1 NA-PP1 inhibiert werden können. Durch eine biochemische Charakterisierung von NtCDPK2 als Modellenzym konnte gezeigt werden, dass es sich bei dieser Mutation in CDPKs um eine funktionell stille Mutation handelte, die keinen Einfluss auf die Kinase¬aktivität und die Substratspezifität hat. Für eine funktionelle Charakterisierung wurden basierend auf Microarray-Expressions¬daten die beiden zu NtCDPK2 homologen Isoformen AtCPK1 und AtCPK2 aus A. thaliana ausgewählt. Anhand klassischer genetischer Methoden, wie der Analyse von Promotor-GUS Linien, konnte gezeigt werden, dass es sich bei AtCPK1 um eine ubiquitär exprimierte CDPK handelt. AtCPK2 zeigte hingegen eine spezifische Lokalisation in der Wurzelspitze und in Zellen, die sich durch Spitzenwachstum auszeichnen, wie beispielsweise Pollen. Eine Untersuchung des Pollenschlauchwachstums in cpk2-Mutanten zeigte, dass die Pollen¬schläuche signifikant kürzer waren als in Wildtyppflanzen. Für eine reverse chemisch-genetische Analyse von AtCPK1 nach Kältestress wurde eine T-DNA Insertionslinie dieser Isoform mit der ATP-Bindetaschen¬variante von AtCPK1 komple¬mentiert. Eine Analyse von Veränderungen im Phosphoproteom nach Kältestress identi¬fizierte 5 Proteine, die ein differentielles Phosphorylierungsmuster nach chemischer Inhibition zeigten. Eine Metabolomanalyse ergab verschiedene Metabolite, die differentiell reguliert wurden. In dieser Arbeit konnte durch eine klassische Mutantenanalyse von AtCPK2, die Etablierung einer chemisch-genetischen Methode für die Analyse von CDPKs und deren Anwendung für AtCPK1 Hinweise auf biologische Funktionen dieser Isoformen erhalten werden. Dies zeigt, dass die chemisch-genetische Methode klassische genetische Ansätze bei der funktionellen Charakterisierung von CDPKs ergänzen kann und, wie im Falle von AtCPK1, oftmals als einzige Methode eine isoformspezifische Untersuchung gestattet. In einem zweiten Teil wurde in dieser Arbeit die Phosphoregulation von CDPKs näher untersucht. Nach Expression in N. benthamiana konnte eine weitere, stimulusabhängige in vivo Phospho¬rylierungs¬stelle in AtCPK2 bestimmt werden. Zudem wurde für eine Phosphorylierungsstelle in der ATP-Bindetasche von NtCDPK2 eine mögliche Funktion in der Regulation der Kinase¬aktivität postuliert. Diese Phosphorylierungsstelle in der ATP-Bindetasche könnte die Basis eines noch nicht beschriebenen Regulationsmechanismus bilden, der Ähnlichkeiten mit der Regulation von Cyclin-abhängigen Kinasen hat

Identifizierung während der Apoptose transkriptionell hochregulierter Gene mittels einer viralen Genfalle und Charakterisierung eines dieser Gene: Phosphatidylinositol 4-Phosphat 5-Kinase Ibeta

Zusammenfassung Für die Gewebehomöostase eines Organismus hat die Apoptose eine grundsätzliche Bedeutung. Fehlregulation des programmierten Zelltods kann entweder zu degenerativen Erkrankungen oder Neoplasien führen. Das Verständnis der dem Phänomen Apoptose zugrunde liegenden molekularen Mechanismen ist sowohl für die Erklärung der Pathogenese dieser Erkrankungen als auch für zukünftige rationale Therapieansätze von Bedeutung. Besonders bei der Entwicklung neuer pharmakologischer Substanzen, die gegen Krebs oder neurodegenerative Krankheiten eingesetzt werden können, ist die Entdeckung neuer apoptoserelevanter Gene von ausschlaggebender Relevanz. Das Ziel dieser Arbeit war daher, neue Gene zu finden, deren Expression während der Apoptose induziert wird, und eines dieser Gene funktionell zu charakterisieren. Als Studiensystem wurden IL-3-abhängige Zellen (FDC P1) benutzt, da die Existenz eines schnell aktivierbaren Apoptose-Signalwegs in verschiedensten Zellen zu dem Schluss geführt hatte, dass Überlebensfaktoren diesen Signalweg reprimieren. IL-3 abhängige Zelllinien hören nicht auf zu proliferieren, wenn ihnen IL-3 entzogen wird, vielmehr durchlaufen sie Apoptose. IL-3 sichert also das Überleben der Zellen dadurch, dass apoptoseaktivierende Signal-Kaskaden reprimiert werden. Um neue Komponenten solcher regulatorischer Kaskaden ausfindig zu machen, war es nötig eine Methode zu entwickeln, die es ermöglicht, Zellen trotz eines Apoptosestimulus am Leben zu erhalten. Eine entsprechende Strategie zur Identifizierung eben solcher Gene, die schon erfolgreich bei eine Reihe anderer Fragestellungen eingesetzt worden war, beruht auf dem Einsatz von Genfallen. Aus der Kombination von Genfalleninsertion und dem Cre/loxP-Rekombinationssystem konnte letztendlich eine Methode entwickelt werden, die die Apoptoseinduktion durch IL-3 Entzug einer strikt IL-3 abhängigen Zelllinie erlaubte. Dabei wird, nach gezielter Rekombination, das Gen für den Überlebensfaktor IL-3 exprimiert. Dadurch werden die Zellen unabhängig von exogen zugeführtem Cytokin. Anders als konventionelle Genfallen-Strategien sollte der Cre/loxP-Ansatz nicht nur eine Anreicherung von Genen erlauben, die durch spezifische biologische Stimuli induziert werden, sondern auch die Identifizierung von nur transient exprimierten Genen ermöglichen. Mit Hilfe eines solchen Ansatzes konnte aus der FDC P1-Zelllinie das Gen Phosphatidylinositol 4-Phosphat 5-Kinase isoliert werden. Zur Validierung der transkriptionellen Induktion der identifizierten Gene wurden Northern-Blot Experimente durchgeführt, die zeigten, dass die Transkriptmenge nur in einem eng begrenzten Zeitfenster ansteigt und danach wieder auf das Ausgangsniveau absinkt. Somit erfüllt das gewählte Genfallensystem auch die Forderung nach der Detektion von nur vorübergehend transkriptionell aktivierten Genen. Die Ergebnisse aus den Proliferationsexperimenten mit FDC P1-Zellen zeigten, dass PIP5K in den Zellzyklus eingreift. PIP5K überexperimierende Zellen haben neben einer erhöhten Proliferationsrate (ca. 3-fach höhere Zellzahlen) auch eine verringerte Spontanapoptose (ca. 70% weniger apoptotische Zellen). In Weichagarexperimenten konnte auch eine erhöhte Stressresistenz der Zellen beobachtet werden (ca. 8-fach unter normalen Il-3 Bedingungen). Nachdem in FDC P1-Zellen nur eine moderate Expression von exogener PIP5K erzielt werden konnte, wurden stabile PIP5K-überexprimierende HeLa-Zellpopulationen isoliert. In einer systematischen, biochemischen Analyse von Zellzyklusregulatoren wurden darüber hinaus PIP5K regulierte Zellzyklusproteine identifiziert. So führte die PIP5K Überexpression zu einer Induktion von PCNA, hsMAD2 und DNA-Polymerase , und zu einer Repression von p21/Cip1/Waf1. Schließlich wurde die Rolle von PIP5K während der, durch alternative Stimuli induzierten Apoptose in HeLa-Zellen untersucht. Es zeigte sich, dass PIP5K die zytostatika- und strahleninduzierte Apoptose akzeleriert. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass PIP5K den Apoptoseprozess, je nach Stimulus, sowohl verzögern als auch beschleunigen kann. Während PIP5K bei IL-3 Entzug anti-apoptotisch wirkt, geschieht genau das Gegenteil nach zytostatischer Behandlung. Insgesamt spiegelt dies eine subtil aufeinander abgestimmte Regulation von Zellzyklus und Apoptose wieder

Charakterisierung der humoralen Immunantwort bei der Multiplen Sklerose

Die MS ist eine chronisch-entzündliche und demyelinisierende Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS), deren Pathomechanismus bislang unbekannt ist. Man findet typischerweise eine Infiltration des ZNS durch Immunzellen, wobei ein heterogenes Bild bezüglich der Qualität der Immunreaktion und der histopathologischen Veränderungen im ZNS von MS-Patienten zu beobachten ist. Obwohl körpereigene Immunzellen wahrscheinlich die Mediatoren der Erkrankung sind, ist bislang nicht geklärt, welche Immunzellen pathogenetisch relevant sind. Da der Liquor cerebrospinalis höchstwahrscheinlich die inflammatorischen Vorgänge im ZNS widerspiegelt, wurde in dieser Arbeit der Liquor auf charakteristische Veränderungen bei der MS analysiert. Dazu wurden Liquor- und Blutzellen von MS-Patienten im Vergleich zu Patienten mit anderen neurologischen Erkrankungen phänotypisiert. Die Analysen zeigten keine wesentlichen Unterschiede im Blut, hingegen war der Liquor von MS-Patienten durch eine Aktivierung der humoralen, B-Zell vermittelten Immunantwort in Form eines erhöhten Anteils an B-Zellen, Plasmazellen und einer Erhöhung der intrathekalen Immunglobulin-G (IgG)-Synthese gekennzeichnet. Je nach Ausprägung der humoralen Immunantwort konnten drei unterschiedliche -im Krankheitsverlauf stabile- Liquorpathologien ausgearbeitet werden: 1. Eine B-Zell dominante Pathologie mit einem hohen Anteil an B-Zellen, wenig Monozyten und einer erhöhten IgG-Synthese, 2. eine Monozyten-dominante Pathologie mit wenig B-Zellen, zahlreichen Monozyten und wenig IgG-Synthese und 3. eine intermediäre Pathologie mit B-Zellen und Monozyten in etwa gleichem Verhältnis und einer moderaten IgG-Synthese. Die Korrelation der unterschiedlichen Liquorpathologien mit klinischen Parametern ergab, dass MS-Patienten mit einer B-Zell dominanten Liquorpathologie eine raschere Krankheitsprogression hatten als Patienten mit umgekehrtem Phänotyp. Die Ergebnisse der Arbeit weisen auf eine Heterogenität in der Liquorpathologie hin und unterstützten die Hypothese, dass die MS eine heterogene Erkrankung mit unterschiedlichen zugrunde liegenden Pathomechanismen ist. Die unterschiedlichen Liquorpathologien geben erstmals die Möglichkeit, die MS-Patienten anhand der Liquortypisierung in Subgruppen zu stratifizieren und möglicherweise eine Aussage über die zu erwartende Krankheitsprogression zu treffen. Der nach wie vor wichtigste Befund für die Diagnose einer MS ist das Auftreten von sogenannten oligoklonalen IgG-Banden (OKBs). OKBs werden im Liquor von mehr als 95% der MS-Patienten beobachtet, während sie nur sehr selten (<1%) bei gesunden Kontrollen zu finden sind. Außerdem sind diese OKBs auch bei anderen chronischen Erkrankungen des ZNS, die durch einen definierten Erreger verursacht sind, zu beobachten. Bei diesen Erkrankungen ist ein Teil der OKBs gegen das krankheitsverursachende Antigen gerichtet. Trotz intensiver Forschung konnten die Zielantigene der Immunantwort bei MS bisher nicht definiert werden. Ziel dieser Arbeit war es mit einem neuen Ansatz die Zielstrukturen der OKBs bei der MS zu identifizieren. Mit Hilfe eines Protein-Arrays, basierend auf einer cDNA-Bibliothek des menschlichen Gehirns, wurden die Immunreaktivitäten von Liquor-Antikörpern ausgewählter MS-Patienten gegen etwa 37000 verschiedene Proteine bestimmt und mit den Reaktivitäten von Kontroll-Liquores verglichen. Mit Hilfe von anschließenden ELISA-Experimenten mit großen MS- und Kontroll-Kollektiven wurden 10 Proteine identifiziert, die bei MS-Patienten höhere Reaktivitäten zeigten als bei Kontrollen. Interessanterweise wurden in den Immunreaktivitäten gegen diese Kandidatenantigene Überlappungen beobachtet, die letztendlich zu zwei Proteingruppen führten. Mit beiden wurde eine ausgedehnte Epitop-Suche durchgeführt. Die Analysen führten schließlich zu zwei Proteinen des Epstein-Barr-Virus (EBV). Es handelte sich dabei um das EBNA-1 und BRRF-2 Protein. Die weiterführenden Experimente zeigten, dass die Immunreaktivitäten gegen diese EBV-Proteine im Serum und Liquor von MS-Patienten höher waren als bei Patienten mit nicht-entzündlichen bzw. mit anderen entzündlichen Erkrankungen des ZNS. Des Weiteren konnte die intrathekale Synthese der EBV-spezifischen Antikörper gezeigt werden. Von besonderer Bedeutung war der Befund, dass die OKBs im Liquor von MS-Patienten spezifisch gegen diese EBV-Proteine gerichtet waren und Teil des gesamten OKB-Musters darstellten. Diese Ergebnisse unterstützen nachdrücklich die Rolle von EBV in der Pathogenese der MS

Die molekulare Logik der nichtribosomalen Peptidsynthetasen: Identifizierung und biochemische Charakterisierung der Biosynthesegene für Gramicidin A

Gramicidin ist ein Polypeptid, das aus 15 hydrophoben Aminosäuren mit alternierender L-D-Konfiguration besteht. In vivo bilden sich Homodimere, die in Membranen als Ionenkanäle fungieren. Die Primärstruktur von Gramicidin A lautet Formyl-Val1-Gly2-Ala3-DLeu4-Ala5-DVal6-Val7-DVal8-Trp9-DLeu10-Trp11-DLeu12-Trp13-DLeu14-Trp15-Ethanolamin. Das Peptid ist am N Terminus durch N Formylierung und am C Terminus durch Ethanolamin vor Abbau geschützt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Genkluster von 61 kb aus B. brevis ATCC 8185 mit Hilfe einer Fosmid-Genbank identifiziert und vollständig sequenziert, der für die Gramicidin A - nichtribosomale Peptidsynthetase (NRPS) kodiert. Ein Multienzym-komplex bestehend aus den 4 NRPS LgrABCD mit jeweils 2, 4, 6 und 4 Modulen konnte für Aufbau und Modifizierung des Pentadekapeptids charakterisiert werden. In silico Untersuchungen zur Definition der Substratspezifität aller 16 Module wurde durch biochemische Untersuchungen an drei Adenylierungsdomänen (LgrA1, LgrA2 und LgrB1) gestützt. Damit konnte das Kolinearitätsprinzip dieser NRPS bewiesen werden. Die putative C-terminale Reduktase (R) – Domäne, die an Modul 16 fusioniert ist, deutete auf die Freisetzung des N-formylierten Peptidsubstrats als Alkohol hin. Biochemische Untersuchungen an der rekombinanten R-Domäne mit Peptidyl-Substratvarianten haben gezeigt, daß diese eine ein-Schritt-Reduktion unter NAD(P)H-Verbrauch zum Aldehyd-Intermediat durchführt. Durch die Verwendung von verschiedenen Substrat-Varianten konnte weiter gezeigt werden, daß die R Domäne eine breite Substrattoleranz besitzt. Die Suche nach einer zweiten Reduktase, die das Peptidyl-Aldehyd zum Endprodukt Peptidyl-Ethanolamin umsetzt, hat zur Entdeckung der Aldoreduktase LgrE geführt. In gekoppelten Assays mit beiden rekombinanten Reduktasen konnte das Peptidyl-Ethanolamin produziert werden. Durch in vitro Umsetzung des enzymatisch hergestellten Peptidyl-Aldehyd-Intermediats mit LgrE konnte die strikte NADPH-Abhängigkeit dieses Enzyms gezeigt werden. Die Aldoreduktase wies im direkten Vergleich zur R Domäne eine stringentere Substratspezifität auf. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine Methode für Modulaustausche in NRPS auf genetischer Ebene entwickelt. Dabei wird zunächst ein Genfragment gekoppelt an einen Marker ins Genom durch homologe Rekombination eingebracht. Im zweiten Schritt wird der Marker über direct repeats durch Ausloopen wieder entfernt. Das Genfragment bleibt erhalten, und das neue NRPS-Produkt kann analysiert werden

Identifizierung und Charakterisierung zweier für die Produktion extrazellulärer Glykolipide verantwortlichen Gencluster in U. maydis

Ustilago maydis produziert unter Stickstoffmangelbedingungen große Mengen an extrazellulären Glykolipiden, das Cellobioselipid Ustilaginsäure und das Mannosylerythritollipid (Ustilipid). In dieser Arbeit wurden die Biosynthesewege und die biologischen Funktionen beider Glykolipide charakterisiert. Zu diesem Zweck wurden Deletionsmutanten hergestellt, die einen Defekt in der Glykolipid-Produktion aufwiesen. Es konnte die Glykosyltransferase Emt1 identifiziert werden, die für die Produktion von Ustilipiden (MELs) essentiell ist. Aufgund der spezifischen Induktion von Emt1 unter Stickstoffmangelbedingungen konnten durch Microarray-Analysen ein Gen-Cluster in Ustilago maydis identifiziert werden, das für die MEL-Biosynthese verantwortlich ist. Dieses MEL-Cluster besteht aus fünf Genen, denen eine Funktion in der Biosynthese zugeordnet werden konnte. Für die Acetyltransferase Mat1 konnte die vorhergesagte Funktion durch einen Enzymassay und massenspektrometrische Messungen bestätigt werden. Durch die Microarray-Analysen konnte auch ein Ustilaginsäure-Cluster und eine weitere Glykosyltransferase (Hgt1) in diesem Cluster identifiziert werden. Beiden Glykolipiden konnten unterschiedliche biologische Funktionen zugeordnet werden. Es zeigte sich, dass die Ustilaginsäuren wichtig für die Pheromonwahrnehmung sind, und dass sie eine toxische Wirkung gegenüber anderen Mikroorganismen besitzen. Die Ustilipide sind besonders starke oberflächenaktive Substanzen und weisen hämolytische Aktivität auf

In vivo-Untersuchungen von Konformations-Änderungen der Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Nicotiana tabacum

Ziel dieser Arbeit war die Detektion von Konformations-Änderungen der Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Tabak (Nicotiana tabacum), die in Abhängigkeit eines Stress-Stimulus induziert werden. Da bislang weder Röntgen- noch NMR-Strukturen für ein Gesamt-Protein einer CDPK bekannt sind, sollten mit verschiedenen in vivo-Methoden Hinweise auf den biochemischen Reaktions-Mechanismus gesammelt werden. Hierzu wurden zum einen intermolekulare Interaktionen einzelner CDPK-Domänen mit dem bereits in Hefe etablierten Split-Ubiquitin (SplitUB) System in trans untersucht. Zum anderen wurde das System auch für eine durch Agrobacterium tumefaciens vermittelte, transiente Expression in der Tabak-Art Nicotiana benthamiana weiterentwickelt und erfolgreich angewandt. Dabei konnte eine Interaktion der Calmodulin-ähnlichen Domäne (CLD) mit der autoinhibitorischen Junction-Domäne (J) der CDPK nachgewiesen werden. Auch das System der "Bimolecular Fluorescence Complementation" wurde für die transiente Expression in N. benthamiana weiterentwickelt und konnte Interaktionen der N-terminalen Domänen (VKJ) mit der CLD nachweisen. Aufgrund stärkerer Hintergrund-Fluoreszenz konnte diese Methode nur Hinweise auf eine mögliche Stimulus-Abhängigkeit der Interaktionen liefern. Neben den intermolekularen Wechselwirkungen wurden auch intramolekulare Interaktionen und somit die Gesamt-Konformation von Proteinen analysiert. Die hierzu verwendete Methode des "Fluorescence Resonance Energy Transfer" (FRET) in cis konnte eine Abhängigkeit der Konformation von der Struktur der Junction-Domäne in planta nachweisen. Zudem wurde das SplitUB-System in cis für die Anwendung in Pflanze weiterentwickelt. Hiermit konnte durch Analysen mutierter Formen von NtCDPK2 eine Abhängigkeit der Konformation von einer biologischen Funktionalität sowohl der Kinase-Domäne als auch von J aufgezeigt werden. Ebenso spielte die Calcium-Affinität der in der CLD lokalisierten EF-Hände eine zentrale Rolle. Diese Ergebnisse vervollständigten ein in der Literatur diskutiertes Aktivierungs-Modell für CDPKs. Aufgrund einer hohen Hintergrund-Abspaltung des Reporters konnten jedoch keine Aussagen über schnelle, dynamische Prozesse wie z.B. nach einer Stimulus-induzierten, transienten Aktivierung des Enzyms getroffen werden. Das SplitUB-System wurde auch für Untersuchungen von Licht-abhängigen Konformations-Änderungen am Beispiel des Cryptochroms AtCRY2 aus Arabidopsis thaliana angewandt. Dieser UV-A- und Blaulicht-Rezeptor ließ einen eindeutigeren Nachweis erwarten, da eine konstante Aktivierung des Enzyms durch Lichteinstrahlung postuliert wird. Es konnte in dieser Arbeit erstmals die Licht-abhängige Konformations-Änderung eines Cryptochroms in vivo nachgewiesen werden. Das SplitUB-System erlaubte es hierbei im Gegensatz zu Untersuchungen an NtCDPK2, auch reziproke und dynamische Unterschiede nach Übergang in Dauerlicht- oder Dauerdunkel-Bedingungen zu detektieren

Allgemeine und funktionelle Untersuchungen zur großen Untereinheit des humanen Replikationsfaktors C (RFC1), sowie initiale Untersuchungen zur Regulation der Expression von RFC1 durch das BCR-ABLp210-Onkogen

In der vorliegenden Arbeit wurden allgemeine und funktionelle Untersuchungen zur großen Untereinheit des humanen Replikationsfaktors C (RFC1) durchgeführt. RFC1 ist als Untereinheit des heteropentameren RFC-Komplexes essentiell an der ATP-abhängigen Beladung des Prozessivitätsfaktors PCNA (Proliferating cell nuclear antigen) an 3Ž-Enden von Primer/Template-Strukturen im Rahmen der DNA-Replikation, wie auch an PCNA-vermittelten DNA-Reparaturprozessen beteiligt. Neben diesen gut charakterisierten Funktionen als essentieller DNA-Replikations- und Reparaturfaktor weisen vereinzelte Untersuchungen auf eine Funktion von RFC1 als transkriptionellen Cofaktor hin, wobei jedoch die funktionelle Bedeutung dieser Beobachtungen in den meisten Fällen bisher nicht näher charakterisiert wurde. Zu Beginn der Arbeit vorliegende Daten ließen auf eine primär transkriptionell regulierte Expression von RFC1 schließen. Die Ergebnisse verschiedener Untersuchungen zur mRNA-Expression von RFC1 bzw. des murinen mRFC1-Gens in untersch

Functional characterization of the homeodomain transcription factor Hdp1 in Ustilago maydis

Ustilago maydis is a phytopathogenic basidiomycete infecting corn plants. Pathogenic development is initiated via a pheromone/receptor-based system encoded by the a-mating type locus. Upon pheromone stimulation, two compatible haploid sporidia form conjugation hyphae that are cell cycle arrested in the G2 phase. Upon fusion of the conjugation tubes, a dikaryotic hyphae is formed in which the G2 cell cycle arrested is maintained until plant penetration. The processes subsequent to the a-mediated fusion are triggered by the b-mating type locus which encodes a pair of homeodomain proteins, termed bE and bW that can form a heterodimeric complex functioning as a transcriptional regulator. hdp1 encodes an a- and b-dependently induced homeodomain transcription factor. Deletion of hdp1 impairs filament formation and G2 cell cycle arrest. Upon fusion of compatible Δhdp1 cells, the resulting filaments are reduced in length, and an increased number of hyphae with more than two nuclei is observed. Similarly, deletion of hdp1 leads to a higher frequency of nuclei with single chromosomal content (1C) in pheromone induced conjugation hyphae, implying that hdp1 is involved in the a-mediated G2 cell cycle arrest. In addition, induced hdp1 expression is sufficient to trigger G2 cell cycle arrest and filament formation. Both Prf1, the main transcriptional regulator within the a-mediated signaling cascade, and Rop1, a factor required for prf1 expression in the saprophytic stage, are induced by Hdp1. Although not required for the pheromone dependent induction of both genes, hdp1 modulates their expression, by that integrating a positive feedback loop from the b-regulatory cascade to the pheromone signaling pathway. Microarray analysis revealed that two genes associated with cell cycle control are regulated by Hdp1. pcl12, encoding a Pho85-type cyclin, is induced, while clb1 encoding a B-type cyclin, is repressed upon hdp1 induction. Deletion of pcl12 abolishes filament formation in axenic culture. The gene appears to be essential for the Hdp1-induced filamentation and G2 cell cycle arrest; however, its effect on cell cycle arrest is most likely also influenced by environmental cues. clb1, on the other hand, does not play a major role in Hdp1-mediated cell cycle arrest. The current model suggests that Hdp1 is used for fine-tuning the a- and b- mediated cell cycle regulation and integrating additional environmental cues

Septin- und Aktomyosindynamik während der Zellteilung von Ustilago maydis

Die Zytokinese stellt den abschließenden Schritt der Zellteilung dar, bei der die physikalische Trennung von Mutter- und Tochterzelle vollzogen wird. Für deren fehlerfreien Ablauf spielt das genaue zeitliche und räumliche Zusammenwirken von Septin- und Aktomyosinstrukturen eine entscheidende Rolle. Der dimorphe Basidiomycet Ustilago maydis vollzieht Zytokinese und Zelltrennung durch die sukzessive Ausbildung zweier Septen. Dabei ist die Aktivität der Proteinkinase Don3 und die der kleinen GTPase Cdc42 essentiell für die Ausbildung des sekundären Septums. Die Wirkung und das Zusammenspiel beider Proteine bei diesem Prozess waren bisher unbekannt. Zentrales Ziel dieser Arbeit war es, die Dynamik der Septin- und Aktomyosin-strukturen während der Zellteilung von U. maydis zu studieren und deren Bedeutung für die Septierung zu verstehen. Durch Lokalisierung des Septins Cdc10 konnte gezeigt werden, dass bereits zu Beginn der Knospung eine Kragen-ähnliche Septinstruktur (Collar) zwischen der Mutter- und Tochterzelle erzeugt wird. Dieser Septincollar markiert die zukünftige Teilungsebene und rekrutiert zu Beginn der Zytokinese die septinspezifische Proteinkinase Gin4. Diese Kinase vermittelt den vollständigen Abbau der Septinstruktur und erzeugt dadurch einen septinfreien Bereich, der die spätere Fragmentierungszone definiert. Unmittelbar neben diesem Bereich wurde die sukzessive Ausbildung neuer Septincollars beobachtet. Zunächst bildete sich ein primärer Septincollar auf der Seite der Mutterzelle und anschließend ein sekundärer auf der Seite der Tochterzelle. Beide Strukturen definieren den Ort der Septenbildung und erfüllen eine vergleichbare Funktion für die Ausbildung des primären bzw. sekundären Septums: Durch die Verwendung des FCH Domänen-Proteins Cdc15 als fluoreszierender Marker konnte der Aufbau eines kontraktilen Aktomyosinrings am Ort des Septincollars beobachtet werden. Unmittelbar darauf erfolgt eine Umwandlung des Septincollars in einen Septinring. Während der anschließenden Kontraktion des Aktomyosinrings findet die Synthese des primären bzw. sekundären Septums statt. Eine detaillierte Untersuchung der Septincollar-zu-Ring Umwandlung wurde durch den Einsatz einer analog-sensitiven Version der Don3 Kinase ermöglicht: Durch Inhibierung der modifizierten Kinase Don3M175A war es möglich, Cluster von Zellen mit stabilem sekundären Septincollar zu erzeugen. Es konnte gezeigt werden, dass diese Struktur als Gerüst für Cdc4 (myosin essential light chain) dient, einer weiteren Komponente des kontraktilen Aktomyosinrings. Interessanterweise führt die Reaktivierung der Kinase unmittelbar zu einem Abbau des zuvor stabilen sekundären Septincollars. Mit diesem Abbau geht die Rekrutierung von Cdc15 einher, welches zusammen mit Cdc4 den kontraktilen Aktomyosinring aufbaut. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Funktion des kontraktilen Rings Cdc15-abhängig und essentiell für den Wiederaufbau der Septinfilamente in Form eines Septinrings ist. Sowohl die primäre als auch sekundäre Septierung wird jeweils mit dem Abbau des Septinrings abgeschlossen. Es zeigte sich, dass der Abbau des sekundären Septinrings abhängig ist von Rts1, der regulatorischen Untereinheit der Protein-phosphatase 2A. Die Wirkung und das Zusammenspiel von Don3 und Cdc42 konnten durch deren sequentielle Aktivierung und Inaktivierung aufgeklärt werden. Beide Proteine sind in zwei unabhängigen Signalkaskaden an der Assemblierung des sekundären Aktomyosinrings beteiligt. Mit diesen Ergebnissen konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass der Wechsel der Septinstrukturen nicht durch eine mechanische Rotation der Septinfilamente in der Ebene der Plasmamembran stattfindet, sondern durch einen Abbau und Wiederaufbau vollzogen wird. Diese Beobachtung lässt vermuten, dass die Septinfilamente eine duale Funktion in knospenden Pilzen übernehmen. Longitudinal ausgerichtete Filamente gewähren die mechanische Stabilität der Knospungsstelle und wirken als Interaktionspartner oder Zielproteine für weitere Proteine wie z.B. die Proteinkinase Gin4 oder für Komponenten des kontraktilen Aktomyosinrings. Diese Struktur wiederum wird für die Assemblierung von umlaufend ausgerichteten Septinfilamenten benötigt, die dann eine essentielle Funktion während der Zelltrennung ausüben

Generierung und Charakterisierung eines neuen Donorstammes für die Influenza Saatvirusherstellung und die Charakterisierung von Influenza Viren in verschiedenen Wirtssystemen

In der Influenza-Impfstoffproduktion ist es von essentieller Bedeutung, gewünschte Antigene (Hämagglutinin und Neuraminidase) in möglichst kurzer Zeit zu erhalten, damit die Bevölkerung gegen die kommenden Influenzaviren schnell und bestmöglich geschützt ist. Derzeit werden die Saatviren in Eiern hergestellt. Dem Wechsel vom humanen Wirt auf Eier folgen bei vielen Viren Mutationen in den beiden Oberflächen-proteinen HA und NA. Diese Veränderungen konnten während der Passagierung von humanen Influenzaisolaten in Eiern gesehen werden. Je weniger Veränderungen die Viren zu humanen Isolaten aufweisen, desto besser kann der spätere Impfstoff schützen, daher ist die Verwendung von Säugerzellen für die Impfstoffproduktion von Vorteil. Weiterhin ist es wichtig, Impfstoff in ausreichenden Mengen zu Beginn einer jeden neuen Grippesaison verfügbar zu haben. Um ein schnelles und ertragreiches Virus-wachstum zu erzielen, ist die Verwendung eines Donorvirus, dessen positive Wachs-tumseigenschaften auf ein Impfvirus übertragen werden, von besonderer Bedeutung. Dazu ist das Wachstum des Donorstammes im verwendeten Wirtssystem entscheidend. Durch mehrfache Passagierung eines Virus aus einer Patientenprobe wurde ein für die MDCK Zelle passendes Donorvirus (NB # 105) etabliert. Die Morphologie des Virus än-derte sich während der Passagierung vom filamentösen Wildtyp-Charakter hin zu sphä-rischen Partikeln. Außerdem zeigten sich Mutationen im HA, welche die Präferenz des Virus zu α2-3 Sialinsäurebindung änderten. Daher wächst NB # 105 deutlich besser und schneller als der bisher verwendete Donorstamm PR8 NYMC sowohl auf der MDCK33016 PF Zelle als auch in Eiern. PR8 RKI zeigte höhere Titer als PR8 NYMC, aber niedrigere Titer als NB # 105. Eine Untersuchung der NA-Aktivität lässt den Rückschluss zu, dass NB # 105 eine optimale Balance zwischen NA-Aktivität und HA-Bindung besitzt, welche beide PR8 Viren nicht erreichen. Durch die hohen Titer, sowohl auf der MDCK33016 PF Zelle als auch in Eiern, könnte man NB # 105 für die Reassortierung in diesen Systemen verwenden. Austausche des HA und NA in einem RG System zeigten, dass sich NB # 105 als Donorvirus zur Herstellung von Reassortanten mit H1N1 und H3N2 Viren eignet, und dass für einige HA/NA Kombinationen (A/California/07/09 und A/Uruguay/716/07) zu höheren Titern wachsende Reassortanten generiert werden konnten als mit dem Laborstamm PR8 NYM