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Identifizierung während der Apoptose transkriptionell hochregulierter Gene mittels einer viralen Genfalle und Charakterisierung eines dieser Gene: Phosphatidylinositol 4-Phosphat 5-Kinase Ibeta
Zusammenfassung
Für die Gewebehomöostase eines Organismus hat die Apoptose eine grundsätzliche Bedeutung. Fehlregulation des programmierten Zelltods kann entweder zu degenerativen Erkrankungen oder Neoplasien führen. Das Verständnis der dem Phänomen Apoptose zugrunde liegenden molekularen Mechanismen ist sowohl für die Erklärung der Pathogenese dieser Erkrankungen als auch für zukünftige rationale Therapieansätze von Bedeutung. Besonders bei der Entwicklung neuer pharmakologischer Substanzen, die gegen Krebs oder neurodegenerative Krankheiten eingesetzt werden können, ist die Entdeckung neuer apoptoserelevanter Gene von ausschlaggebender Relevanz.
Das Ziel dieser Arbeit war daher, neue Gene zu finden, deren Expression während der Apoptose induziert wird, und eines dieser Gene funktionell zu charakterisieren. Als Studiensystem wurden IL-3-abhängige Zellen (FDC P1) benutzt, da die Existenz eines schnell aktivierbaren Apoptose-Signalwegs in verschiedensten Zellen zu dem Schluss geführt hatte, dass Überlebensfaktoren diesen Signalweg reprimieren. IL-3 abhängige Zelllinien hören nicht auf zu proliferieren, wenn ihnen IL-3 entzogen wird, vielmehr durchlaufen sie Apoptose. IL-3 sichert also das Überleben der Zellen dadurch, dass apoptoseaktivierende Signal-Kaskaden reprimiert werden. Um neue Komponenten solcher regulatorischer Kaskaden ausfindig zu machen, war es nötig eine Methode zu entwickeln, die es ermöglicht, Zellen trotz eines Apoptosestimulus am Leben zu erhalten.
Eine entsprechende Strategie zur Identifizierung eben solcher Gene, die schon erfolgreich bei eine Reihe anderer Fragestellungen eingesetzt worden war, beruht auf dem Einsatz von Genfallen. Aus der Kombination von Genfalleninsertion und dem Cre/loxP-Rekombinationssystem konnte letztendlich eine Methode entwickelt werden, die die Apoptoseinduktion durch IL-3 Entzug einer strikt IL-3 abhängigen Zelllinie erlaubte. Dabei wird, nach gezielter Rekombination, das Gen für den Überlebensfaktor IL-3 exprimiert. Dadurch werden die Zellen unabhängig von exogen zugeführtem Cytokin. Anders als konventionelle Genfallen-Strategien sollte der Cre/loxP-Ansatz nicht nur eine Anreicherung von Genen erlauben, die durch spezifische biologische Stimuli induziert werden, sondern auch die Identifizierung von nur transient exprimierten Genen ermöglichen. Mit Hilfe eines solchen Ansatzes konnte aus der FDC P1-Zelllinie das Gen Phosphatidylinositol 4-Phosphat 5-Kinase isoliert werden.
Zur Validierung der transkriptionellen Induktion der identifizierten Gene wurden Northern-Blot Experimente durchgeführt, die zeigten, dass die Transkriptmenge nur in einem eng begrenzten Zeitfenster ansteigt und danach wieder auf das Ausgangsniveau absinkt. Somit erfüllt das gewählte Genfallensystem auch die Forderung nach der Detektion von nur vorübergehend transkriptionell aktivierten Genen.
Die Ergebnisse aus den Proliferationsexperimenten mit FDC P1-Zellen zeigten, dass PIP5K in den Zellzyklus eingreift. PIP5K überexperimierende Zellen haben neben einer erhöhten Proliferationsrate (ca. 3-fach höhere Zellzahlen) auch eine verringerte Spontanapoptose (ca. 70% weniger apoptotische Zellen). In Weichagarexperimenten konnte auch eine erhöhte Stressresistenz der Zellen beobachtet werden (ca. 8-fach unter normalen Il-3 Bedingungen).
Nachdem in FDC P1-Zellen nur eine moderate Expression von exogener PIP5K erzielt werden konnte, wurden stabile PIP5K-ĂĽberexprimierende HeLa-Zellpopulationen isoliert. In einer systematischen, biochemischen Analyse von Zellzyklusregulatoren wurden darĂĽber hinaus PIP5K regulierte Zellzyklusproteine identifiziert. So fĂĽhrte die PIP5K Ăśberexpression zu einer Induktion von PCNA, hsMAD2 und DNA-Polymerase , und zu einer Repression von p21/Cip1/Waf1. SchlieĂźlich wurde die Rolle von PIP5K während der, durch alternative Stimuli induzierten Apoptose in HeLa-Zellen untersucht. Es zeigte sich, dass PIP5K die zytostatika- und strahleninduzierte Apoptose akzeleriert.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass PIP5K den Apoptoseprozess, je nach Stimulus, sowohl verzögern als auch beschleunigen kann. Während PIP5K bei IL-3 Entzug anti-apoptotisch wirkt, geschieht genau das Gegenteil nach zytostatischer Behandlung.
Insgesamt spiegelt dies eine subtil aufeinander abgestimmte Regulation von Zellzyklus und Apoptose wieder
Funktionelle Charakterisierung von AtCPK1 und AtCPK2 aus Arabidopsis thaliana unter Verwendung einer chemisch-genetischen Methode
Kalzium-abhängige Proteinkinasen (CDPKs) haben eine biologische Funktion in einer Reihe von zellulären Prozessen, was durch Überexpressionsanalysen und auf Kosuppression-basierten Silencing-Untersuchungen gezeigt werden konnte. Die Untersuchung von CDPK-Mutanten hat jedoch bisher, vermutlich aufgrund der hohen funktionellen Redundanz oder aufgrund von Anpassungsmechanismen der Pflanzen, zu keinen phänotypischen Auffällig¬keiten geführt. Ausschließlich im Falle von NtCDPK2 aus Tabak war es bislang möglich, die biologische Funktion einer einzelnen Isoform aufzuklären.
In dieser Arbeit wurde eine chemisch-genetische Methode etabliert, die es ermöglicht, isoformspezifische Untersuchungen von CDPKs durchzuführen. Eine Mutation der ATP-Bindetasche verändert die Nukeotid¬binde¬eigen¬schaften von CDPKs daraufhin, dass sie durch den Kinaseinhibitor 1 NA-PP1 inhibiert werden können. Durch eine biochemische Charakterisierung von NtCDPK2 als Modellenzym konnte gezeigt werden, dass es sich bei dieser Mutation in CDPKs um eine funktionell stille Mutation handelte, die keinen Einfluss auf die Kinase¬aktivität und die Substratspezifität hat.
Für eine funktionelle Charakterisierung wurden basierend auf Microarray-Expressions¬daten die beiden zu NtCDPK2 homologen Isoformen AtCPK1 und AtCPK2 aus A. thaliana ausgewählt. Anhand klassischer genetischer Methoden, wie der Analyse von Promotor-GUS Linien, konnte gezeigt werden, dass es sich bei AtCPK1 um eine ubiquitär exprimierte CDPK handelt. AtCPK2 zeigte hingegen eine spezifische Lokalisation in der Wurzelspitze und in Zellen, die sich durch Spitzenwachstum auszeichnen, wie beispielsweise Pollen. Eine Untersuchung des Pollenschlauchwachstums in cpk2-Mutanten zeigte, dass die Pollen¬schläuche signifikant kürzer waren als in Wildtyppflanzen.
Für eine reverse chemisch-genetische Analyse von AtCPK1 nach Kältestress wurde eine T-DNA Insertionslinie dieser Isoform mit der ATP-Bindetaschen¬variante von AtCPK1 komple¬mentiert. Eine Analyse von Veränderungen im Phosphoproteom nach Kältestress identi¬fizierte 5 Proteine, die ein differentielles Phosphorylierungsmuster nach chemischer Inhibition zeigten. Eine Metabolomanalyse ergab verschiedene Metabolite, die differentiell reguliert wurden.
In dieser Arbeit konnte durch eine klassische Mutantenanalyse von AtCPK2, die Etablierung einer chemisch-genetischen Methode für die Analyse von CDPKs und deren Anwendung für AtCPK1 Hinweise auf biologische Funktionen dieser Isoformen erhalten werden. Dies zeigt, dass die chemisch-genetische Methode klassische genetische Ansätze bei der funktionellen Charakterisierung von CDPKs ergänzen kann und, wie im Falle von AtCPK1, oftmals als einzige Methode eine isoformspezifische Untersuchung gestattet.
In einem zweiten Teil wurde in dieser Arbeit die Phosphoregulation von CDPKs näher untersucht. Nach Expression in N. benthamiana konnte eine weitere, stimulusabhängige in vivo Phospho¬rylierungs¬stelle in AtCPK2 bestimmt werden. Zudem wurde für eine Phosphorylierungsstelle in der ATP-Bindetasche von NtCDPK2 eine mögliche Funktion in der Regulation der Kinase¬aktivität postuliert. Diese Phosphorylierungsstelle in der ATP-Bindetasche könnte die Basis eines noch nicht beschriebenen Regulationsmechanismus bilden, der Ähnlichkeiten mit der Regulation von Cyclin-abhängigen Kinasen hat
Charakterisierung der humoralen Immunantwort bei der Multiplen Sklerose
Die MS ist eine chronisch-entzĂĽndliche und
demyelinisierende Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS),
deren Pathomechanismus bislang unbekannt ist. Man findet
typischerweise eine Infiltration des ZNS durch Immunzellen,
wobei ein heterogenes Bild bezüglich der Qualität der
Immunreaktion und der histopathologischen Veränderungen im ZNS
von MS-Patienten zu beobachten ist. Obwohl körpereigene
Immunzellen wahrscheinlich die Mediatoren der Erkrankung sind,
ist bislang nicht geklärt, welche Immunzellen pathogenetisch
relevant sind. Da der Liquor cerebrospinalis
höchstwahrscheinlich die inflammatorischen Vorgänge im ZNS
widerspiegelt, wurde in dieser Arbeit der Liquor auf
charakteristische Veränderungen bei der MS analysiert. Dazu
wurden Liquor- und Blutzellen von MS-Patienten im Vergleich zu
Patienten mit anderen neurologischen Erkrankungen
phänotypisiert. Die Analysen zeigten keine wesentlichen
Unterschiede im Blut, hingegen war der Liquor von MS-Patienten
durch eine Aktivierung der humoralen, B-Zell vermittelten
Immunantwort in Form eines erhöhten Anteils an B-Zellen,
Plasmazellen und einer Erhöhung der intrathekalen
Immunglobulin-G (IgG)-Synthese gekennzeichnet. Je nach
Ausprägung der humoralen Immunantwort konnten drei
unterschiedliche -im Krankheitsverlauf stabile-
Liquorpathologien ausgearbeitet werden: 1. Eine B-Zell
dominante Pathologie mit einem hohen Anteil an B-Zellen, wenig
Monozyten und einer erhöhten IgG-Synthese, 2. eine
Monozyten-dominante Pathologie mit wenig B-Zellen, zahlreichen
Monozyten und wenig IgG-Synthese und 3. eine intermediäre
Pathologie mit B-Zellen und Monozyten in etwa gleichem
Verhältnis und einer moderaten IgG-Synthese. Die Korrelation
der unterschiedlichen Liquorpathologien mit klinischen
Parametern ergab, dass MS-Patienten mit einer B-Zell dominanten
Liquorpathologie eine raschere Krankheitsprogression hatten als
Patienten mit umgekehrtem Phänotyp. Die Ergebnisse der Arbeit
weisen auf eine Heterogenität in der Liquorpathologie hin und
unterstĂĽtzten die Hypothese, dass die MS eine heterogene
Erkrankung mit unterschiedlichen zugrunde liegenden
Pathomechanismen ist. Die unterschiedlichen Liquorpathologien
geben erstmals die Möglichkeit, die MS-Patienten anhand der
Liquortypisierung in Subgruppen zu stratifizieren und
möglicherweise eine Aussage über die zu erwartende
Krankheitsprogression zu treffen. Der nach wie vor wichtigste
Befund fĂĽr die Diagnose einer MS ist das Auftreten von
sogenannten oligoklonalen IgG-Banden (OKBs). OKBs werden im
Liquor von mehr als 95% der MS-Patienten beobachtet, während
sie nur sehr selten (<1%) bei gesunden Kontrollen zu finden
sind. AuĂźerdem sind diese OKBs auch bei anderen chronischen
Erkrankungen des ZNS, die durch einen definierten Erreger
verursacht sind, zu beobachten. Bei diesen Erkrankungen ist ein
Teil der OKBs gegen das krankheitsverursachende Antigen
gerichtet. Trotz intensiver Forschung konnten die Zielantigene
der Immunantwort bei MS bisher nicht definiert werden. Ziel
dieser Arbeit war es mit einem neuen Ansatz die Zielstrukturen
der OKBs bei der MS zu identifizieren. Mit Hilfe eines
Protein-Arrays, basierend auf einer cDNA-Bibliothek des
menschlichen Gehirns, wurden die Immunreaktivitäten von
Liquor-Antikörpern ausgewählter MS-Patienten gegen etwa 37000
verschiedene Proteine bestimmt und mit den Reaktivitäten von
Kontroll-Liquores verglichen. Mit Hilfe von anschlieĂźenden
ELISA-Experimenten mit groĂźen MS- und Kontroll-Kollektiven
wurden 10 Proteine identifiziert, die bei MS-Patienten höhere
Reaktivitäten zeigten als bei Kontrollen. Interessanterweise
wurden in den Immunreaktivitäten gegen diese Kandidatenantigene
Ăśberlappungen beobachtet, die letztendlich zu zwei
Proteingruppen fĂĽhrten. Mit beiden wurde eine ausgedehnte
Epitop-Suche durchgefĂĽhrt. Die Analysen fĂĽhrten schlieĂźlich zu
zwei Proteinen des Epstein-Barr-Virus (EBV). Es handelte sich
dabei um das EBNA-1 und BRRF-2 Protein. Die weiterfĂĽhrenden
Experimente zeigten, dass die Immunreaktivitäten gegen diese
EBV-Proteine im Serum und Liquor von MS-Patienten höher waren
als bei Patienten mit nicht-entzĂĽndlichen bzw. mit anderen
entzĂĽndlichen Erkrankungen des ZNS. Des Weiteren konnte die
intrathekale Synthese der EBV-spezifischen Antikörper gezeigt
werden. Von besonderer Bedeutung war der Befund, dass die OKBs
im Liquor von MS-Patienten spezifisch gegen diese EBV-Proteine
gerichtet waren und Teil des gesamten OKB-Musters darstellten.
Diese Ergebnisse unterstĂĽtzen nachdrĂĽcklich die Rolle von EBV
in der Pathogenese der MS
Die molekulare Logik der nichtribosomalen Peptidsynthetasen: Identifizierung und biochemische Charakterisierung der Biosynthesegene fĂĽr Gramicidin A
Gramicidin ist ein Polypeptid, das aus 15 hydrophoben Aminosäuren mit alternierender L-D-Konfiguration besteht. In vivo bilden sich Homodimere, die in Membranen als Ionenkanäle fungieren. Die Primärstruktur von Gramicidin A lautet Formyl-Val1-Gly2-Ala3-DLeu4-Ala5-DVal6-Val7-DVal8-Trp9-DLeu10-Trp11-DLeu12-Trp13-DLeu14-Trp15-Ethanolamin. Das Peptid ist am N Terminus durch N Formylierung und am C Terminus durch Ethanolamin vor Abbau geschützt.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein Genkluster von 61 kb aus B. brevis ATCC 8185 mit Hilfe einer Fosmid-Genbank identifiziert und vollständig sequenziert, der für die Gramicidin A - nichtribosomale Peptidsynthetase (NRPS) kodiert. Ein Multienzym-komplex bestehend aus den 4 NRPS LgrABCD mit jeweils 2, 4, 6 und 4 Modulen konnte für Aufbau und Modifizierung des Pentadekapeptids charakterisiert werden. In silico Untersuchungen zur Definition der Substratspezifität aller 16 Module wurde durch biochemische Untersuchungen an drei Adenylierungsdomänen (LgrA1, LgrA2 und LgrB1) gestützt. Damit konnte das Kolinearitätsprinzip dieser NRPS bewiesen werden.
Die putative C-terminale Reduktase (R) – Domäne, die an Modul 16 fusioniert ist, deutete auf die Freisetzung des N-formylierten Peptidsubstrats als Alkohol hin. Biochemische Untersuchungen an der rekombinanten R-Domäne mit Peptidyl-Substratvarianten haben gezeigt, daß diese eine ein-Schritt-Reduktion unter NAD(P)H-Verbrauch zum Aldehyd-Intermediat durchführt. Durch die Verwendung von verschiedenen Substrat-Varianten konnte weiter gezeigt werden, daß die R Domäne eine breite Substrattoleranz besitzt.
Die Suche nach einer zweiten Reduktase, die das Peptidyl-Aldehyd zum Endprodukt Peptidyl-Ethanolamin umsetzt, hat zur Entdeckung der Aldoreduktase LgrE geführt. In gekoppelten Assays mit beiden rekombinanten Reduktasen konnte das Peptidyl-Ethanolamin produziert werden. Durch in vitro Umsetzung des enzymatisch hergestellten Peptidyl-Aldehyd-Intermediats mit LgrE konnte die strikte NADPH-Abhängigkeit dieses Enzyms gezeigt werden. Die Aldoreduktase wies im direkten Vergleich zur R Domäne eine stringentere Substratspezifität auf.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine Methode für Modulaustausche in NRPS auf genetischer Ebene entwickelt. Dabei wird zunächst ein Genfragment gekoppelt an einen Marker ins Genom durch homologe Rekombination eingebracht. Im zweiten Schritt wird der Marker über direct repeats durch Ausloopen wieder entfernt. Das Genfragment bleibt erhalten, und das neue NRPS-Produkt kann analysiert werden
Identifizierung und Charakterisierung zweier für die Produktion extrazellulärer Glykolipide verantwortlichen Gencluster in U. maydis
Ustilago maydis produziert unter Stickstoffmangelbedingungen große Mengen an extrazellulären Glykolipiden, das Cellobioselipid Ustilaginsäure und das Mannosylerythritollipid (Ustilipid). In dieser Arbeit wurden die Biosynthesewege und die biologischen Funktionen beider Glykolipide charakterisiert. Zu diesem Zweck wurden Deletionsmutanten hergestellt, die einen Defekt in der Glykolipid-Produktion aufwiesen. Es konnte die Glykosyltransferase Emt1 identifiziert werden, die für die Produktion von Ustilipiden (MELs) essentiell ist. Aufgund der spezifischen Induktion von Emt1 unter Stickstoffmangelbedingungen konnten durch Microarray-Analysen ein Gen-Cluster in Ustilago maydis identifiziert werden, das für die MEL-Biosynthese verantwortlich ist. Dieses MEL-Cluster besteht aus fünf Genen, denen eine Funktion in der Biosynthese zugeordnet werden konnte.
Für die Acetyltransferase Mat1 konnte die vorhergesagte Funktion durch einen Enzymassay und massenspektrometrische Messungen bestätigt werden. Durch die Microarray-Analysen konnte auch ein Ustilaginsäure-Cluster und eine weitere Glykosyltransferase (Hgt1) in diesem Cluster identifiziert werden.
Beiden Glykolipiden konnten unterschiedliche biologische Funktionen zugeordnet werden. Es zeigte sich, dass die Ustilaginsäuren wichtig für die Pheromonwahrnehmung sind, und dass sie eine toxische Wirkung gegenüber anderen Mikroorganismen besitzen. Die Ustilipide sind besonders starke oberflächenaktive Substanzen und weisen hämolytische Aktivität auf
In vivo-Untersuchungen von Konformations-Änderungen der Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Nicotiana tabacum
Ziel dieser Arbeit war die Detektion von Konformations-Ă„nderungen der
Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Tabak (Nicotiana tabacum), die
in Abhängigkeit eines Stress-Stimulus induziert werden. Da bislang weder
Röntgen- noch NMR-Strukturen für ein Gesamt-Protein einer CDPK bekannt sind,
sollten mit verschiedenen in vivo-Methoden Hinweise auf den biochemischen
Reaktions-Mechanismus gesammelt werden. Hierzu wurden zum einen
intermolekulare Interaktionen einzelner CDPK-Domänen mit dem bereits in Hefe
etablierten Split-Ubiquitin (SplitUB) System in trans untersucht. Zum
anderen wurde das System auch fĂĽr eine durch Agrobacterium tumefaciens
vermittelte, transiente Expression in der Tabak-Art Nicotiana benthamiana
weiterentwickelt und erfolgreich angewandt. Dabei konnte eine Interaktion
der Calmodulin-ähnlichen Domäne
(CLD) mit der autoinhibitorischen Junction-Domäne (J) der CDPK nachgewiesen
werden. Auch das System der "Bimolecular Fluorescence Complementation" wurde
fĂĽr die transiente Expression in N. benthamiana weiterentwickelt und konnte
Interaktionen der N-terminalen Domänen (VKJ) mit der CLD nachweisen.
Aufgrund stärkerer Hintergrund-Fluoreszenz konnte diese Methode nur Hinweise
auf eine mögliche Stimulus-Abhängigkeit der Interaktionen liefern. Neben den
intermolekularen Wechselwirkungen wurden auch intramolekulare Interaktionen
und somit die Gesamt-Konformation von Proteinen analysiert. Die hierzu
verwendete Methode des "Fluorescence Resonance Energy Transfer" (FRET) in
cis konnte eine Abhängigkeit der Konformation von der Struktur der
Junction-Domäne in planta nachweisen. Zudem wurde das SplitUB-System in cis
fĂĽr die Anwendung in Pflanze weiterentwickelt.
Hiermit konnte durch Analysen mutierter Formen von NtCDPK2 eine Abhängigkeit
der Konformation von einer biologischen Funktionalität sowohl der
Kinase-Domäne als auch von J aufgezeigt werden. Ebenso spielte die
Calcium-Affinität der in der CLD lokalisierten EF-Hände eine zentrale Rolle.
Diese Ergebnisse vervollständigten ein in der Literatur diskutiertes
Aktivierungs-Modell fĂĽr CDPKs. Aufgrund einer hohen Hintergrund-Abspaltung
des Reporters konnten jedoch keine Aussagen ĂĽber schnelle, dynamische
Prozesse wie z.B. nach einer Stimulus-induzierten, transienten Aktivierung
des Enzyms getroffen werden. Das SplitUB-System wurde auch fĂĽr
Untersuchungen von Licht-abhängigen Konformations-Änderungen am Beispiel des
Cryptochroms AtCRY2 aus Arabidopsis thaliana angewandt. Dieser UV-A- und
Blaulicht-Rezeptor lieĂź einen eindeutigeren Nachweis erwarten, da eine
konstante Aktivierung des Enzyms durch Lichteinstrahlung postuliert wird. Es
konnte in dieser Arbeit erstmals die Licht-abhängige Konformations-Änderung
eines Cryptochroms in vivo nachgewiesen werden. Das SplitUB-System erlaubte
es hierbei im Gegensatz zu Untersuchungen an NtCDPK2, auch reziproke und
dynamische Unterschiede nach Ăśbergang in Dauerlicht- oder
Dauerdunkel-Bedingungen zu detektieren
Allgemeine und funktionelle Untersuchungen zur groĂźen Untereinheit des humanen Replikationsfaktors C (RFC1), sowie initiale Untersuchungen zur Regulation der Expression von RFC1 durch das BCR-ABLp210-Onkogen
In der vorliegenden Arbeit wurden allgemeine und funktionelle Untersuchungen zur großen Untereinheit des humanen Replikationsfaktors C (RFC1) durchgeführt. RFC1 ist als Untereinheit des heteropentameren RFC-Komplexes essentiell an der ATP-abhängigen Beladung des Prozessivitätsfaktors PCNA (Proliferating cell nuclear antigen) an 3Ž-Enden von Primer/Template-Strukturen im Rahmen der DNA-Replikation, wie auch an PCNA-vermittelten DNA-Reparaturprozessen beteiligt. Neben diesen gut charakterisierten Funktionen als essentieller DNA-Replikations- und Reparaturfaktor weisen vereinzelte Untersuchungen auf eine Funktion von RFC1 als transkriptionellen Cofaktor hin, wobei jedoch die funktionelle Bedeutung dieser Beobachtungen in den meisten Fällen bisher nicht näher charakterisiert wurde.
Zu Beginn der Arbeit vorliegende Daten ließen auf eine primär transkriptionell regulierte Expression von RFC1 schließen. Die Ergebnisse verschiedener Untersuchungen zur mRNA-Expression von RFC1 bzw. des murinen mRFC1-Gens in untersch
Multiallelic recognition: Nonself-dependent dimerization of the bE and bW homeodomain proteins in ustilago maydis
AbstractIn the plant pathogenic fungus Ustilago maydis, sexual and pathogenic development are controlled by the multiallelic b mating-type locus. The b locus encodes a pair of unrelated homeodomain proteins termed bE and bW, with allelic differences clustering in the N-terminal domains of both polypeptides. Only combinations of bE and bW of different allelic origin are active. We have investigated the underlying molecular mechanism for this intracellular self/nonself recognition phenomenon. By using the two-hybrid system, we were able to show that bE and bW dimerize only if they are derived from different alleles. Dimerization involves the N-terminal variable domains. Different point mutants of bE2 were isolated that function in combination with bW2. The majority of such bE2 mutant polypeptides were also able to form heterodimers with bW2 in the two-hybrid system. Nonself-dependent dimerization of bE and bW was supported with a biochemical interaction assay with immobilized proteins. Our results suggest a model for self/nonself recognition in which variable cohesive contacts direct dimerization
A two-component regulatory system for self/non-self recognition in Ustilago maydis
AbstractIn U. maydis the multiallelic b locus controls sexual and pathogenic development. In the b locus a gene coding for a regulatory protein had been identified, and it was suggested that the interaction of two b polypeptides specified by different alleles programs sexual development in this fungus. We now demonstrate the existence of a second regulatory gene in the b locus. We term this gene bW and refer to the former as the bE gene. Both genes exist in many alleles. Although unrelated in primary sequence, both genes are similar in their overall organization. The gene products display allele-specific variability in their N-terminal domains, show a high degree of sequence conservation in the C-terminal domains, and contain a homeodomain-related motif. Genetic evidence is provided to show that the pair of bE and bW polypeptides encoded by different b alleles is the key regulatory species
Septation of Infectious Hyphae Is Critical for Appressoria Formation and Virulence in the Smut Fungus Ustilago Maydis
Differentiation of hyphae into specialized infection structures, known as appressoria, is a common feature of plant pathogenic fungi that penetrate the plant cuticle. Appressorium formation in U. maydis is triggered by environmental signals but the molecular mechanism of this hyphal differentiation is largely unknown. Infectious hyphae grow on the leaf surface by inserting regularly spaced retraction septa at the distal end of the tip cell leaving empty sections of collapsed hyphae behind. Here we show that formation of retraction septa is critical for appressorium formation and virulence in U. maydis. We demonstrate that the diaphanous-related formin Drf1 is necessary for actomyosin ring formation during septation of infectious hyphae. Drf1 acts as an effector of a Cdc42 GTPase signaling module, which also consists of the Cdc42-specific guanine nucleotide exchange factor Don1 and the Ste20-like kinase Don3. Deletion of drf1, don1 or don3 abolished formation of retraction septa resulting in reduced virulence. Appressorium formation in these mutants was not completely blocked but infection structures were found only at the tip of short filaments indicating that retraction septa are necessary for appressorium formation in extended infectious hyphae. In addition, appressoria of drf1 mutants penetrated the plant tissue less frequently
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