Comparative Systems Biology analyses of Lactococcus lactis subsp. lactis strain LMG 19460

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020Lactic acid bacteria (LAB) have long had a prominent role in human society, where many of its individuals are used to produce various fermented food products and a few others are clinicallyrelevant pathogens. Since the late twenty-first century, many of these bacteria have also demonstrated their potential as biotechnological organisms, thanks to their proven safety for human health. Lactococcus lactis is one of such LAB, with a long history in the production of dairy products and a recently well established role in biotechnology. There, L. lactis strains have been used as microbial cell factories for the production of recombinant protein, as vectors for mucosal vaccination, and more. L. lactis subsp. lactis LMG 19460 is a strain whose genome was recently sequenced and whose lack of intrinsic plasmids makes it an ideal candidate for biotechnological applications. For the better understanding and use of such biotechnological organisms, genome-scale metabolic models, or genome-scale models (GEMs), can be a great tool. However, developing robust GEMs for organisms which have no available experimental data can be a difficult task, since they cannot be validated through comparison with published phenotypes. As such, strategies different from traditional methodologies are necessary. Here, two GEMs were developed, one for the well characterised, reference strain L. lactis subsp. lactis IL1403 and another for L. lactis LMG 19460. The GEM for L. lactis IL1403 accounts for 575 genes, 921 reactions and 639 metabolites. It was reconstructed through comparative genomic approaches, where metabolic functions in strain IL1403 were inferred from high-quality published GEMs. The assembled model was then refined and validated through comparison with the comprehensive published data available for the organism. The model demonstrates good capabilities in predicting experimentally determined phenotypes of strain IL1403. Using this validated and working model, a GEM was then developed for the lesser-known strain LMG 19460. The metabolic model for L. lactis LMG 19460 accounts for 570 genes, 916 reactions and 638 metabolites. It is a functional model, capable of performing in silico predictions using data available for other L. lactis strains. However, it still requires true validation through comparison with experimentally determined, strainspecific phenotypes. As a first step in the experimental characterisation of L. lactis LMG 19460, a chemically defined medium was here developed and optimised, supporting clear growth and considerable biomass production when compared with published media (final OD600 = 2.02). The GEM for L. lactis LMG 19460 is capable of simulating unconstrained growth in this medium. In future applications, both metabolic reconstructions here assembled should be further refined and validated, in order to fully develop them into high-quality GEMs. Then, these models will be of significant use for further studying the metabolism of their respective strains, where they can be usedto map high-throughput data and drive experimental design. Furthermore, by testing synthetic biology hypothesis and predicting the effects of metabolic engineering, these models will be invaluable tools for the applications of their respective strains in biotechnology.As bacterias do acido lactico (BAL), correspondentes a ordem taxonomica Lactobacillales, sao um grupo de bacterias Gram-positivas com baixo conteudo G+C, caracterizadas por produzirem acido lactico como principal produto do metabolismo. Sao um grupo altamente diversificado, quer nas suas caracteristicas fisionomicas, quer no leque de habitats que ocupam, os quais vao desde numerosos produtos alimentares fermentados, a ambientes vegetais, superficies animais e vias gastrointestinais. Embora alguns membros desta ordem sejam agentes patogenicos, a maioria destas especies e reconhecida como segura para a saude humana. Estes microrganismos estao tradicionalmente associados a industria alimentar, onde servem para a producao de variados produtos fermentados. Mais ainda, desde o final do seculo vinte, tem vindo a adquirir um papel cada vez mais relevante na area da biotecnologia. Uma das especies mais bem caracterizadas no grupo de BAL e Lactococcus lactis. Esta bacteria partilha ja uma longa historia com o ser humano, em grande parte devido ao seu uso na producao de inumeros lacticinios. Recentemente, adquiriu tambem um papel distinto na biotecnologia, onde a sua seguranca para a saude humana lhe confere inumeras vantagens sobre os organismos tradicionalmente utilizados nesta area. Um exemplo destas aplicacoes e a sua utilizacao como fabrica celular microbiana para a producao de inumeros compostos e enzimas de relevancia industrial. Outro exemplo, e a sua aplicacao nas areas da terapeutica e imunologia, onde L. lactis tem sido utilizada para a producao e administracao in vivo de compostos terapeuticos e para a vacinacao atraves de mucosas. A estirpe L. lactis spp. lactis LMG 19460, cujo genoma foi recentemente sequenciado, e uma boa candidata para estas varias aplicacoes biotecnologicas. Isto deve-se, em particular, ao facto de nao ter plasmideos intrinsecos, o que reduz os seus custos metabolicos e permite, em principio, maior rendimento na producao de proteina recombinante. Qualquer aplicacao biotecnologica de um organismo beneficia de um conhecimento integral e abrangente das suas funcoes celulares, nomeadamente do seu metabolismo. Para alcancar essa compreensao holistica, existem na area da biologia de sistemas inumeras ferramentas, dais quais se destacam os modelos metabolicos a escala genomica (MMEG). Estes modelos sao representações matematicas e, consequentemente, computacionais de todas funcoes metabolicas de um dado organismo, permitindo, assim, simular estados fisiologicos e prever fenotipos em variadas condições ambientais. Surgiram no final dos anos 1990, logo apos a sequenciacao dos primeiros genomas, e tem desde entao sido desenvolvidos para cada vez mais organismos, cobrindo agora todos os dominios da vida celular. Quando estes modelos sao gerados de um modo cuidado e compreensivo, resultam em MMEG de alta qualidade, que podem, entao, ser aplicados para inumeros fins. Destes, destacam-se particularmente o mapeamento de dados omicos, permitindo, assim, a melhor interpretacao dos mesmos, e, reciprocamente, a melhoria e o refinamento do modelo. Destacam-se, tambem, as aplicacoes na area da biotecnologia, designadamente na biologia sintetica e engenharia metabolica. Ai, MMEG simulam, entre outras coisas, a insercao de plasmideos e manipulacoes geneticas, permitindo, assim, testar hipoteses antes da sua aplicacao experimental. A construcao de um MMEG e um processo trabalhoso e minucioso que, de modo geral, segue quatro passos essenciais. No primeiro, e gerada uma reconstrucao esboco da rede metabolica do organismo em questao. No segundo passo, o esboco obtido e revisto e refinado, de modo a conceder maior qualidade e realismo a reconstrucao metabolica, mas tambem para lhe dar a estrutura necessária aos passos seguintes. O terceiro passo e a conversao da rede metabolica para um formato matemático e, consequentemente, computacional. A lista das reacoes metabolicas de uma reconstrucao pode ser representada numa matriz, denominada matriz estequiometrica (ou matriz S), onde as colunas correspondem a cada reacao, as linhas a metabolitos e as entradas aos seus respetivos coeficientes estequiometricos. E esta abstracao da rede metabolica numa matriz matematica que permite a computacao de estados fisiologicos e previsao de fenotipos. O ultimo passo para o desenvolvimento de um MMEG e a sua avaliacao e validacao. Em primeiro, sao analisados e corrigidos possiveis erros na rede metabolica, e, de seguida, as capacidades do modelo sao validadas pela comparacao com dados experimentais. Como tal, para desenvolver o modelo de um dado organismo, e essencial que exista boa e variada literatura experimental para o mesmo. Alternativamente, estes dados experimentais podem ser obtidos em paralelo ao desenvolvimento do modelo. Para organismos cuja literatura metabolica e bastante limitada ou inexistente, sao, entao, necessarias estrategias alternativas para a construcao e validacao do seu MMEG. Neste trabalho foram desenvolvidos dois MMEG, um para a estirpe de referencia L. lactis spp. lactis IL1403 e outro para a estirpe L. lactis LMG 19460. O MMEG para a estirpe IL1403 contabiliza 575 genes, 921 reacoes e 639 metabolitos. Para a sua construcao, foram aplicadas abordagens de genomica comparativa que permitiram inferir as funcoes metabolicas de L. lactis IL1403. Nomeadamente, foram detetadas homologias bidirecionais entre a estripe e uma serie de organismosalvo para os quais estao publicados MMEG de alta qualidade. De seguida, foram corrigidos erros na rede metabolica e o modelo foi validado pela comparacao das suas capacidades com dados disponíveis na extensa literatura de L. lactis IL1403. O MMEG resultante demonstra boas capacidades de simular fenotipos determinados experimentalmente, tais como, requisitos nutritivos, capacidade de utilizar diferentes fontes de carbono, crescimento em meios quimicamente definidos e crescimento respeitante de taxas especificas de consumo de nutrientes e producao de metabolitos. Apos a construcao de um MMEG para L. lactis IL1403 validado e funcional, o mesmo foi utilizado como base para inferir as funcoes metabolicas da estirpe LMG 19460, ainda não caracterizada ao nivel do seu metabolismo. O MMEG aqui desenvolvido para L. lactis LMG 19460 contabiliza 570 genes, 916 reacoes e 638 metabolitos. E funcional e capaz de simular crescimento e diferentes fenotipos quando utilizados dados publicados para outras estirpes de L. lactis. De qualquer forma, para a sua correta validacao e melhoria da especificidade, as capacidades deste modelo precisam de ser comparadas com dados experimentais especificos a estirpe, ainda a obter. De modo a iniciar o processo da caracterizacao metabolica de L. lactis LMG 19460, foi aqui desenvolvido um meio quimicamente definido capaz de suster crescimento da estirpe. Este meio e constituido por uma fonte de carbono, todos os aminoacidos e uma serie de vitaminas, minerais e outros micronutrientes. Pela sua otimizacao, nomeadamente no que diz respeito a concentracao da fonte de carbono e tampao, foi possivel obter um meio capaz de suster uma producao consideravel de biomassa de L. lactis LMG 19460 (densidade otica final de 2,02, a 600 nm). De modo a iniciar, tambem, o processo de validacao do MMEG desenvolvido para este organismo, o meio aqui construido foi aplicado como condicoes ambientais in silico. Depois, o modelo foi avaliado quanto a sua capacidade de reproduzir a ocorrencia de crescimento verificada in vitro; teste para o qual foi positivo. De qualquer forma, sao ainda necessarios muitos mais dados experimentais para corretamente validar o modelo para L. lactis LMG 19460. No futuro serao necessarios ainda mais esforcos de refinamento e validacao dos dois modelos aqui construidos, de modo a eventualmente torna-los em MMEG de alta qualidade. Para o modelo de L. lactis IL1403, isto significa continuar o trabalho de revisao de todas as reacoes incluidas, quer pela continuacao da pesquisa de funcoes metabolicas na respetiva literatura publicada, quer pela investigacao mais detalhada das homologias aqui detetadas entre a estirpe e os organismos-alvo utilizados. Mais ainda, o processo de validacao pode ser melhorado e continuado pela obtencao de dados experimentais de maior qualidade e dados ainda nao disponiveis para a estirpe, tais como a determinacao dos seus genes letais. Quanto ao modelo de L. lactis LMG 19460, tudo o que foi referido para o anterior modelo aplica-se tambem a este, com o acrescimo de ser necessaria a obtencao de ainda mais dados experimentais especificos a estirpe. Estes dados serao, tais como, a determinacao das suas auxotrofias e requisitos nutritivos, a sua capacidade de utilizar diferentes fontes de carbono e as suas taxas de consumo de nutrientes e producao de metabolitos. So quando determinados estes fenotipos da estirpe e que sera possivel a devida validacao do MMEG. Para muitos destes fins, pode ser aplicado o meio sintetico aqui desenvolvido. Este deve tambem continuar a ser desenvolvido e otimizado para o crescimento de L. lactis LMG 19460. Quando atingido o ponto da alta qualidade, os MMEG aqui desenvolvidos para as duas estirpes de L. lactis poderao entao ser utilizados para fins mais aplicados, tais como o estudo detalhado dos seus processos metabolicos, a previsao realistica de fenotipos resultantes de manipulações geneticas e a participacao no desenho e otimizacao destas estirpes como fabricas celulares microbianas

NEOTROPICAL CARNIVORES: a data set on carnivore distribution in the Neotropics

Mammalian carnivores are considered a key group in maintaining ecological health and can indicate potential ecological integrity in landscapes where they occur. Carnivores also hold high conservation value and their habitat requirements can guide management and conservation plans. The order Carnivora has 84 species from 8 families in the Neotropical region: Canidae; Felidae; Mephitidae; Mustelidae; Otariidae; Phocidae; Procyonidae; and Ursidae. Herein, we include published and unpublished data on native terrestrial Neotropical carnivores (Canidae; Felidae; Mephitidae; Mustelidae; Procyonidae; and Ursidae). NEOTROPICAL CARNIVORES is a publicly available data set that includes 99,605 data entries from 35,511 unique georeferenced coordinates. Detection/non-detection and quantitative data were obtained from 1818 to 2018 by researchers, governmental agencies, non-governmental organizations, and private consultants. Data were collected using several methods including camera trapping, museum collections, roadkill, line transect, and opportunistic records. Literature (peer-reviewed and grey literature) from Portuguese, Spanish and English were incorporated in this compilation. Most of the data set consists of detection data entries (n = 79,343; 79.7%) but also includes non-detection data (n = 20,262; 20.3%). Of those, 43.3% also include count data (n = 43,151). The information available in NEOTROPICAL CARNIVORES will contribute to macroecological, ecological, and conservation questions in multiple spatio-temporal perspectives. As carnivores play key roles in trophic interactions, a better understanding of their distribution and habitat requirements are essential to establish conservation management plans and safeguard the future ecological health of Neotropical ecosystems. Our data paper, combined with other large-scale data sets, has great potential to clarify species distribution and related ecological processes within the Neotropics. There are no copyright restrictions and no restriction for using data from this data paper, as long as the data paper is cited as the source of the information used. We also request that users inform us of how they intend to use the data