Intramyokardiale Transplantation MNP-beladener Zellen unter Verwendung spezieller Magnetfelder nach Herzschädigung

Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die häufigste Todesursache in der westlichen Hemisphäre. Der Verlust von funktionellen Herzmuskelzellen (Kardiomyozyten) und die fehlende Regenerationsfähigkeit des Herzmuskels nach einem akuten Myokardinfarkt vermindern die Pumpfunktion des Herzens und führen zum klinischen Bild der Herzinsuffizienz. Als aussichtsreiche kausale Therapieform zur Regeneration akuter oder chronisch ischämischer Herzerkrankungen wird bereits der zelluläre Gewebeersatz (Kardiomyoplastie) wissenschaftlich behandelt. Ein großes Hindernis dieser Therapieform stellt jedoch ein großer Zellverlust dar, bedingt durch den Injektionskanal und die Herzkontraktion während und unmittelbar nach der intramyokardialen Injektion, was in einer geringen Zellintegrationsrate im Infarktareal und in einer nur moderaten Verbesserung der Herzfunktion resultiert. Um dieser Problematik entgegenzuwirken, wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene Zelltypen, wie Knochenmarkzellen (BMC), embryonale Kardiomyozyten (eCM) und ES-Zell abgeleitete Kardiomyozyten (ES-CM), mit Magnetischen Nanopartikeln (MNP) beladen und in Kombination mit einem geeigneten Magnetfeld intramyokardial injiziert, um die Zellintegrationsrate sowie die Herzfunktion für eine Kurz- und Langzeit Therapie deutlich verbessern zu können. Zunächst wurden verschiedene in vitro Vor-Experimenten unter Verwendung von eCM (E13.5 – 15.5) durchgeführt, um den für eine Zellbeladung am besten geeigneten MNP charakterisieren zu können. Dabei zeigten MPS- (magnetic particle spectroscopy) und Toxizitätsanalysen, dass der MNP SO-Mag5 eine gute Zellbeladungseffizienz aufwies und keine toxischen Auswirkungen auf die Zell-Vitalität hatte. Basierend auf den Ergebnissen der in vitro Vor-Versuche wurden für die in vivo Experimente BMC, eCM und ES-CM mit SO Mag5 Partikeln beladen und intramyokardial in ein kryoinfarziertes Mausherz injiziert. Um die transplantierten Zellen postoperativ bereits im nativen Myokard identifizieren zu können, wurden transgene Mäuse und Stammzelllinien verwendet, die das Reportergen eGFP bzw. DS-Red exprimierten. Während und 10 Minuten nach der Injektion wurde ein 1,3 Tesla Stabmagnet in einem Abstand von 5 mm über dem Herzen positioniert. In der Kontrollgruppe wurde auf das Magnetfeld verzichtet. Mit Magnetischem Targeting konnte bei allen verwendeten Zelltypen 14 Tage nach der Zelltransplantation eine bis zu 7-fach verbesserte Zellintegrationsrate nachgewiesen werden, gegenüber einer Injektion ohne Magnet, bei einem Großteil der Zellen bereits während und unmittelbar nach der Injektion aus dem Myokard gespült wurden. Quantitative Fluoreszenz-Untersuchungen und Biolumineszenz Analysen von Luciferase transduzierten eCM bestätigten die signifikant verbesserte intramyokardiale Zellintegration, bedingt durch das Magnetische Targeting. Die Effektivität der Magnet basierten Zellinjektion wurde besonders durch Langzeitversuche deutlich, da auch hier 8 Wochen nach der Zellinjektion eine dreifach verbesserte Zellintegrationsrate unter Magnet Applikation festgestellt werden konnte. Zudem wurden mit Hilfe der links- und rechtsventrikulären Katheterisierung eine deutlich verbesserte Herzfunktion bei Kurz- und Langzeit Studien sowie eine verminderte elektrische Vulnerabilität in Kurzzeit Studien unter Einsatz eines Magnetfeldes aufgezeigt. Um den Mechanismus der Magnet basierten Zellinjektion entschlüsseln zu können, wurden in der vorliegenden Arbeit MPS Analysen zur Bestimmung des Eisengehaltes der injizierten SO Mag5 Partikel durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass durch das Magnetische Targeting schon intraoperativ, durch Unterbindung des Zell Refluxes aus dem Stichkanal, mechanisch mehr Zellen im Myokard festgehalten werden können, als ohne Magnet Applikation. Zudem zeigten Caspase3 und Ki 67 Färbungen eine signifikant geringere Apoptose- und höhere Proliferationsraten in der frühen postoperativen Phase (Tag 2 und 3) bei der Magnet basierten Zellinjektion auf. Zusätzliche Phosphohistone-H3 Färbungen bestätigten das signifikant erhöhte proliferative Verhalten der unter Magnetkraft injizierten SO Mag5 beladenen eCM. Zusammenfassend konnten durch die vorliegende Arbeit gezeigt werden, dass die MNP basierten Zellinjektion unter lokaler Magnetfeldanwendung zu einer signifikant verbesserten Zellinjektionsrate (bis Faktor 7) und zu einer deutlich verbesserten Herzfunktion, auch im Langzeitverlauf, führte. Dabei spielen zugleich mechanische und biologische Mechanismen eine entscheidende Rolle

Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status

Even though the mammalian heart has been investigated for many years, there are still uncertainties in the fields of cardiac cell biology and regeneration with regard to exact fractions of cardiomyocytes (CMs) at different developmental stages, their plasticity after cardiac lesion and also their basal turnover rate. A main shortcoming is the accurate identification of CM and the demonstration of CM division. Therefore, an in vivo model taking advantage of a live reporter-based identification of CM nuclei and their cell cycle status is needed. In this technical report, we describe the generation and characterization of embryonic stem cells and transgenic mice expressing a fusion protein of human histone 2B and the red fluorescence protein mCherry under control of the CM specific alpha MHC promoter. This fluorescence label allows unequivocal identification and quantitation of CM nuclei and nuclearity in isolated cells and native tissue slices. In ventricles of adults, we determined a fraction of <20 % CMs and binucleation of 77-90 %, while in atria a CM fraction of 30 % and a binucleation index of 14 % were found. We combined this transgenic system with the CAG-eGFP-anillin transgene, which identifies cell division and established a novel screening assay for cell cycle-modifying substances in isolated, postnatal CMs. Our transgenic live reporter-based system enables reliable identification of CM nuclei and determination of CM fractions and nuclearity in heart tissue. In combination with CAG-eGFP-anillin-mice, the cell cycle status of CMs can be monitored in detail enabling screening for proliferation-inducing substances in vitro and in vivo