Plasmaproteinbindung endogener Glucocorticosteroide und deren Einfluss auf Haar- und Speichelkonzentrationen

Glucocorticosteroide (GC) spielen für viele endogene Prozesse im Organismus eine wichtige Rolle. Sie regulieren die Gluconeogenese sowie den Lipid- und Proteinstoffwechsel. Außerdem sind sie für die Stressregulierung über die Hypothalamus-Nebennierenrinden-Achse verantwortlich. Therapeutisch kommen die GCs wegen ihrer entzündungshemmenden Wirkung zum Einsatz und werden u.a. bei Asthma und Gelenkentzündungen angewandt. Diese Eigenschaft macht sie auch interessant für den Gebrauch im Sportbereich. Dort wird ihre Anwendung über die Weltantidopingagentur reguliert. Ihr oraler, intramuskulärer, intravenöser und rektaler Gebrauch ist im Wettkampf verboten. Diese Einschränkung bzgl. des Applikationszeitraumes und des Applikationsweges erschwert die diagnostische Aussagekraft von Routinedopingproben, welche im Urin durchgeführt werden. Ein Grenzwert von 30 ng/ml soll einen legalen Gebrauch von einem Missbrauch abgrenzen. Die endogenen Glucocorticosteroide stellen hierbei jedoch einen Graubereich dar. Endogen wird Cortisol in einem zirkadianen Rhythmus produziert und die Produktion ist stressinduziert. Somit kommt es zu ausgeprägten intra- und interindividuellen Streuungen der endogenen Produktion. Dadurch bedingt ist eine Abgrenzung der endogenen Produktion von einer legalen Anwendung bzw. einem Missbrauch im Rahmen der Dopingrichtlinien im Urin nicht möglich. Speziell für den Nachweis von endogenen Substanzen ist es wichtig, eine Methode zu finden, mit der es möglich ist, die endogene Produktion von einer exogenen Bezugsquelle abzugrenzen. Dabei haben sich zwei Wege als hilfreich herausgestellt. Zum einen, wenn die Differenzierung nicht an Hand von Absolutkonzentrationen sondern durch die Anwendung von Analytverhältnissen durchgeführt wird. Zum anderen, wenn zusätzliche Untersuchungen im Speichel oder Haar durchgeführt werden. Haar- und Speichelproben zählen zu den ergänzenden Matrizes der Routineuntersuchungsmedien Urin und Blut und werden bereits in vielen forensischen und klinischen Laboren für diagnostische Fragestellungen verwendet. Diese Matrizes liefern wichtige Hinweise auf den akuten (Speichel) oder chronischen/ zurückliegenden (Haar) Gebrauch bzw. Missbrauch von Medikamenten und Drogen. Sowohl die Haar- als auch Speichelmatrix sollen den physiologisch aktiven Anteil von Substanzen im Blut widerspiegeln und somit korrektere Rückschlüsse auf deren Wirksamkeit zulassen. Das endogene Glucocorticosteroid Cortisol steht seit der Jahrtausendwende im Blickpunkt vieler Forschungen, welche sich mit dessen Bedeutung für die Stressantwort befassen und Cortisol u.a. im Speichel und Haar nachweisen. Auffällig ist dabei, dass die ersten Arbeiten fast ausschließlich mittels immunchemischen Nachweisverfahren erfolgten. Erst in den letzten fünf Jahren wurde vermehrt LC-MS/MS-Verfahren angewandt. Vorteil dieser ist, dass der Nachweis von Substanzen selektiv erfolgt und Kreuzreaktionen nicht stattfinden. Weiterhin ist es vorteilhaft, dass die Konzentrationen von mehreren Analyten mit einer Messung bestimmt werden können. So ist es zum Beispiel möglich Cortisol und andere Steroide, z.B. dem Cortison parallel nachzuweisen. Cortison spielt für die physiologische Wirkung der Glucocorticosteroide im Körper keine Rolle, da es selbst nicht biologisch aktiv ist. Deshalb wurde es in bisherigen Forschungen für diagnostische Aussagen nicht berücksichtigt. Mit Verwendung der LC-MS/MS-Technologie werden jedoch beide endogenen GCs zunehmend nebeneinander bestimmt. Bei der Betrachtung von unterschiedlichen Untersuchungsmedien ist auffällig, dass sich die Konzentrationsverhältnisse Cortisol zu Cortison unterscheiden. Entgegengesetzte Verhält-nisse werden ersichtlich, wenn die GC-Konzentrationen im Blut mit denen im Speichel bzw. Haar verglichen werden. Bisher wurden diese Beobachtungen mit der lokalen Wirksamkeit von Enzymen, welche die Corticosteroide ineinander umwandeln, erklärt. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde folgender Fragestellung für die Nachweisbarkeit der Glucocorticosteroide nachgegangen: „Wie hoch ist der Anteil der Plasmaproteinbindung der GCs im Blut und welche Rückschlüsse lassen sich daraus auf die Konzentrationsverschiebung innerhalb der einzelnen Matrizes ziehen?“ Basierend auf die einzelnen Teilprojekte wurden sowohl Plasmaproben als auch Speichel- und Haarproben hinsichtlich ihrer GC-Konzentrationen analysiert. Die Untersuchung von Kontrollproben ermöglichte es, Referenzwerte unter Normalbedingungen zu erheben. Die Ergebnisse aus den Projekten ergaben, dass die beiden endogen GCs Cortisol und Cortison in unterschiedlichen Konzentrationsverhältnissen in den Analysenmedien vorkommen: Plasma: Gesamtkonzentration F:E ca. 3:1 freie Konzentrationen F:E ca. 1:1 Speichel: F:E ca. 1:5 Haar: F:E ca. 1:3 Die Bestimmung der Plasmaproteinbindung (PPB) beider endogener GCs hat gezeigt, dass Cortisol mit ca. 96 % stärker an die Transportproteine CBG und Albumin bindet als Cortison mit ca. 85 %. Dies führt dazu, dass sich die freien, nicht-proteingebundenen Konzentrationen angleichen und es zu einer Verhältnisverschiebung von Cortisol zu Cortison von 3:1 auf 1:1 kommt. Somit stehen vergleichbare Konzentrationen für die Inkorporation ins Haar bzw. die Diffusion in den Speichel zur Verfügung. Es konnte gezeigt werden, dass die freien Plasmakonzentrationen beider GC stark mit den Speichelkonzentrationen korrelieren. Cortisol aber unterproportional und Cortison überproportional vom Plasma in den Speichel übergeht. Dies kann mit zwei weiteren Mechanismen, welche während der Diffusion eine Rolle spielen, der unterschiedlichen Lipophilie und der Inaktivierung durch lokale Enzym-reaktionen, erklärt werden. Weiterhin wurde gezeigt, dass sich die Tagesrhythmik der GC-Produktion im Speichel abbilden lässt und eine starke Korrelation zwischen Cortison und Cortisol vorliegt. Mit Hilfe einer Grenzfunktion können endogene Referenzkonzentrationen definiert und Messdaten eingeordnet werden. Unter anderem wurde gezeigt, dass eine Hormonersatztherapie mit Hydrocortison zu einer Verschiebung der Metabolisierung und der PPB führt und somit ein Gebrauch/Missbrauch von GCs durch abweichende Konzentrationsverhältnisse nachweisbar ist. Speicheluntersuchungen während einer chronischen Stresssituation (Schwangerschaft) zeigen, dass die GC-Produktion stetig ansteigt und sich besonders die morgendlichen Werte unterscheiden. Um die tageszeitlichen und stressbedingten Schwankungen der GC-Produktion auszublenden und eine längere Zeitspanne zu betrachten, wurden zusätzlich Haarproben analysiert. In diesen wurde ein kontinuierlicher Anstieg der GCs in den proximalen Haarsegmenten nachgewiesen, was auf eine kontinuierlich erhöhte Inkorporation während der chronischen Stresssituation schließen lässt. Außerdem wurde gezeigt, dass die Haarkonzentrationen dem Auswascheffekt unterliegen und die nachweisbaren Konzentrationen geringer werden, je älter das Haar wird. Schlussfolgernd kann gesagt werden, dass beide Mechanismen (Einlagerung und Auswaschung) konkurrieren und deshalb Referenzdaten nur für das proximale Segment erhoben werden können. Für weitere Segmente sind die Auswirkungen der individuellen Einflüsse nicht mehr allgemeingültig kalkulierbar und nur noch intraindividuelle Vergleiche nach mehrmaliger Beprobung aussagekräftig. Sind die Effekte der verstärkten Inkorporation größer als die Auswaschung, lassen sich diese auch Monate später erkennen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Plasmaproteinbindung der GCs zur Verhältnisverschiebung der Konzentrationen im Blut, Speichel und Haar beiträgt. Etwa 50 % des beobachteten Effekts kann der PPB zugeordnet werden. Weitere Quellen sind die unterschiedliche Lipophilie der GCs und die enzymatische Umwandlung, welche im Rahmen der vorliegenden Arbeit jedoch nicht „quantitativ“ betrachtet wurden. Die enzymatische Inaktivierung wurde bis dato als Hauptverantwortliche für die Konzentrationsverschiebung diskutiert. Mit der aktuellen Arbeit wurde dies widerlegt, und die Plasmaproteinbindung als Hauptquelle identifiziert

Diagnostic Value of Concentration Profiles of Glucocorticosteroids and Endocannabinoids in Hair

Background:Endogenous corticosteroids and endocannabinoids are both known to be involved in stress adaption and anti-inflammatory and immuneregulatory effects. The application of hair as retrospective specimen for long-term recording of corticosteroids and its association with stress-induced biochemical alterations was intensively examined.Methods:To evaluate the stability and correlation of various parameters of the endocannabinoid and corticosteroid systems, a prospective study was carried out. Hair samples were collected monthly over a pregnancy cycle (sixth week of pregnancy to 9 weeks postpartum). By comparison of hair concentrations in particular segments (ie, grown in the same time span but collected at different times), an examination of analyte stability in hair was achieved. Additionally, the comparison of proximal segments provided on biochemical information that is independent of alteration due to physical instability. The detection limits of a validated procedure using solid-phase extraction cleanup and liquid chromatography-mass spectrometry proved to be suitable to identify the endogenous levels of cortisol (limits of detection = 1.6 pg/mg), cortisone (2.1 pg/mg), anandamide (AEA, 0.3 pg/mg), and 2-arachidonoylglycerol (15 pg/mg).Results:Corticosteroid concentrations in corresponding hair segments were found to be reduced with increasing hair age; an average decline of cortisol and cortisone by 50% in 4 months was estimated. Independently, an increase of cortisol and cortisone in proximal segments collected during pregnancy was confirmed, which is assumed to be stress related. Endocannabinoids proved to be by far more stable, as demonstrated by subsequent monthly collection of corresponding segments and there was hardly any washout of AEA detectable. Elevated hair concentrations of AEA and 2-arachidonoylglycerol were detected in the first-second trimester of pregnancy, which corresponds to negative correlations between AEA, cortisol, and cortisone

Associating Emergency Medical Services personnel's workload, trauma exposure, and health with the cortisol, endocannabinoid, and N-acylethanolamine concentrations in their hair

In their line of duty, Emergency Medical Services (EMS) personnel are exposed to chronically stressful working conditions and recurrent traumatic events, which increase their risk for detrimental health outcomes. Here, we investigated whether this risk is due to altered regulation of the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis and the endocannabinoid system. Therefore, 1 cm hair strands were collected from a cohort of 72 German EMS personnel in order to measure concentrations of cortisol, endocannabinoids [i.e., anandamide (AEA), 2-arachidonoylglycerol (2-AG)], and N-acylethanolamines [i.e., stearoylethanolamide (SEA), oleoylethanolamide (OEA), and palmitoylethanolamide (PEA)]. Rank correlation analyses were conducted to test associations of cortisol, endocannabinoid, and N-acylethanolamine concentrations with the EMS personnel's workload, lifetime trauma exposure, and mental and physical health problems. We found a negative correlation between cortisol and 2-AG concentrations in hair. Higher hair cortisol was associated with higher workload. Reported traumatic stress during childhood and later in life as well as more severe depressive and physical stress symptoms were associated with elevated 2-AG, SEA, OEA, and PEA concentrations. Future longitudinal research needs to address the prospect of tracing biomolecular markers of glucocorticoid, endocannabinoid, and N-acylethanolamine activity as a predicting value of the long-term course of mental and physical well-being

Plasmaproteinbindung endogener Glucocorticosteroide und deren Einfluss auf Haar- und Speichelkonzentrationen

Glucocorticosteroide (GC) spielen für viele endogene Prozesse im Organismus eine wichtige Rolle. Sie regulieren die Gluconeogenese sowie den Lipid- und Proteinstoffwechsel. Außerdem sind sie für die Stressregulierung über die Hypothalamus-Nebennierenrinden-Achse verantwortlich. Therapeutisch kommen die GCs wegen ihrer entzündungshemmenden Wirkung zum Einsatz und werden u.a. bei Asthma und Gelenkentzündungen angewandt. Diese Eigenschaft macht sie auch interessant für den Gebrauch im Sportbereich. Dort wird ihre Anwendung über die Weltantidopingagentur reguliert. Ihr oraler, intramuskulärer, intravenöser und rektaler Gebrauch ist im Wettkampf verboten. Diese Einschränkung bzgl. des Applikationszeitraumes und des Applikationsweges erschwert die diagnostische Aussagekraft von Routinedopingproben, welche im Urin durchgeführt werden. Ein Grenzwert von 30 ng/ml soll einen legalen Gebrauch von einem Missbrauch abgrenzen. Die endogenen Glucocorticosteroide stellen hierbei jedoch einen Graubereich dar. Endogen wird Cortisol in einem zirkadianen Rhythmus produziert und die Produktion ist stressinduziert. Somit kommt es zu ausgeprägten intra- und interindividuellen Streuungen der endogenen Produktion. Dadurch bedingt ist eine Abgrenzung der endogenen Produktion von einer legalen Anwendung bzw. einem Missbrauch im Rahmen der Dopingrichtlinien im Urin nicht möglich. Speziell für den Nachweis von endogenen Substanzen ist es wichtig, eine Methode zu finden, mit der es möglich ist, die endogene Produktion von einer exogenen Bezugsquelle abzugrenzen. Dabei haben sich zwei Wege als hilfreich herausgestellt. Zum einen, wenn die Differenzierung nicht an Hand von Absolutkonzentrationen sondern durch die Anwendung von Analytverhältnissen durchgeführt wird. Zum anderen, wenn zusätzliche Untersuchungen im Speichel oder Haar durchgeführt werden. Haar- und Speichelproben zählen zu den ergänzenden Matrizes der Routineuntersuchungsmedien Urin und Blut und werden bereits in vielen forensischen und klinischen Laboren für diagnostische Fragestellungen verwendet. Diese Matrizes liefern wichtige Hinweise auf den akuten (Speichel) oder chronischen/ zurückliegenden (Haar) Gebrauch bzw. Missbrauch von Medikamenten und Drogen. Sowohl die Haar- als auch Speichelmatrix sollen den physiologisch aktiven Anteil von Substanzen im Blut widerspiegeln und somit korrektere Rückschlüsse auf deren Wirksamkeit zulassen. Das endogene Glucocorticosteroid Cortisol steht seit der Jahrtausendwende im Blickpunkt vieler Forschungen, welche sich mit dessen Bedeutung für die Stressantwort befassen und Cortisol u.a. im Speichel und Haar nachweisen. Auffällig ist dabei, dass die ersten Arbeiten fast ausschließlich mittels immunchemischen Nachweisverfahren erfolgten. Erst in den letzten fünf Jahren wurde vermehrt LC-MS/MS-Verfahren angewandt. Vorteil dieser ist, dass der Nachweis von Substanzen selektiv erfolgt und Kreuzreaktionen nicht stattfinden. Weiterhin ist es vorteilhaft, dass die Konzentrationen von mehreren Analyten mit einer Messung bestimmt werden können. So ist es zum Beispiel möglich Cortisol und andere Steroide, z.B. dem Cortison parallel nachzuweisen. Cortison spielt für die physiologische Wirkung der Glucocorticosteroide im Körper keine Rolle, da es selbst nicht biologisch aktiv ist. Deshalb wurde es in bisherigen Forschungen für diagnostische Aussagen nicht berücksichtigt. Mit Verwendung der LC-MS/MS-Technologie werden jedoch beide endogenen GCs zunehmend nebeneinander bestimmt. Bei der Betrachtung von unterschiedlichen Untersuchungsmedien ist auffällig, dass sich die Konzentrationsverhältnisse Cortisol zu Cortison unterscheiden. Entgegengesetzte Verhält-nisse werden ersichtlich, wenn die GC-Konzentrationen im Blut mit denen im Speichel bzw. Haar verglichen werden. Bisher wurden diese Beobachtungen mit der lokalen Wirksamkeit von Enzymen, welche die Corticosteroide ineinander umwandeln, erklärt. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde folgender Fragestellung für die Nachweisbarkeit der Glucocorticosteroide nachgegangen: „Wie hoch ist der Anteil der Plasmaproteinbindung der GCs im Blut und welche Rückschlüsse lassen sich daraus auf die Konzentrationsverschiebung innerhalb der einzelnen Matrizes ziehen?“ Basierend auf die einzelnen Teilprojekte wurden sowohl Plasmaproben als auch Speichel- und Haarproben hinsichtlich ihrer GC-Konzentrationen analysiert. Die Untersuchung von Kontrollproben ermöglichte es, Referenzwerte unter Normalbedingungen zu erheben. Die Ergebnisse aus den Projekten ergaben, dass die beiden endogen GCs Cortisol und Cortison in unterschiedlichen Konzentrationsverhältnissen in den Analysenmedien vorkommen: Plasma: Gesamtkonzentration F:E ca. 3:1 freie Konzentrationen F:E ca. 1:1 Speichel: F:E ca. 1:5 Haar: F:E ca. 1:3 Die Bestimmung der Plasmaproteinbindung (PPB) beider endogener GCs hat gezeigt, dass Cortisol mit ca. 96 % stärker an die Transportproteine CBG und Albumin bindet als Cortison mit ca. 85 %. Dies führt dazu, dass sich die freien, nicht-proteingebundenen Konzentrationen angleichen und es zu einer Verhältnisverschiebung von Cortisol zu Cortison von 3:1 auf 1:1 kommt. Somit stehen vergleichbare Konzentrationen für die Inkorporation ins Haar bzw. die Diffusion in den Speichel zur Verfügung. Es konnte gezeigt werden, dass die freien Plasmakonzentrationen beider GC stark mit den Speichelkonzentrationen korrelieren. Cortisol aber unterproportional und Cortison überproportional vom Plasma in den Speichel übergeht. Dies kann mit zwei weiteren Mechanismen, welche während der Diffusion eine Rolle spielen, der unterschiedlichen Lipophilie und der Inaktivierung durch lokale Enzym-reaktionen, erklärt werden. Weiterhin wurde gezeigt, dass sich die Tagesrhythmik der GC-Produktion im Speichel abbilden lässt und eine starke Korrelation zwischen Cortison und Cortisol vorliegt. Mit Hilfe einer Grenzfunktion können endogene Referenzkonzentrationen definiert und Messdaten eingeordnet werden. Unter anderem wurde gezeigt, dass eine Hormonersatztherapie mit Hydrocortison zu einer Verschiebung der Metabolisierung und der PPB führt und somit ein Gebrauch/Missbrauch von GCs durch abweichende Konzentrationsverhältnisse nachweisbar ist. Speicheluntersuchungen während einer chronischen Stresssituation (Schwangerschaft) zeigen, dass die GC-Produktion stetig ansteigt und sich besonders die morgendlichen Werte unterscheiden. Um die tageszeitlichen und stressbedingten Schwankungen der GC-Produktion auszublenden und eine längere Zeitspanne zu betrachten, wurden zusätzlich Haarproben analysiert. In diesen wurde ein kontinuierlicher Anstieg der GCs in den proximalen Haarsegmenten nachgewiesen, was auf eine kontinuierlich erhöhte Inkorporation während der chronischen Stresssituation schließen lässt. Außerdem wurde gezeigt, dass die Haarkonzentrationen dem Auswascheffekt unterliegen und die nachweisbaren Konzentrationen geringer werden, je älter das Haar wird. Schlussfolgernd kann gesagt werden, dass beide Mechanismen (Einlagerung und Auswaschung) konkurrieren und deshalb Referenzdaten nur für das proximale Segment erhoben werden können. Für weitere Segmente sind die Auswirkungen der individuellen Einflüsse nicht mehr allgemeingültig kalkulierbar und nur noch intraindividuelle Vergleiche nach mehrmaliger Beprobung aussagekräftig. Sind die Effekte der verstärkten Inkorporation größer als die Auswaschung, lassen sich diese auch Monate später erkennen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Plasmaproteinbindung der GCs zur Verhältnisverschiebung der Konzentrationen im Blut, Speichel und Haar beiträgt. Etwa 50 % des beobachteten Effekts kann der PPB zugeordnet werden. Weitere Quellen sind die unterschiedliche Lipophilie der GCs und die enzymatische Umwandlung, welche im Rahmen der vorliegenden Arbeit jedoch nicht „quantitativ“ betrachtet wurden. Die enzymatische Inaktivierung wurde bis dato als Hauptverantwortliche für die Konzentrationsverschiebung diskutiert. Mit der aktuellen Arbeit wurde dies widerlegt, und die Plasmaproteinbindung als Hauptquelle identifiziert

Plasmaproteinbindung endogener Glucocorticosteroide und deren Einfluss auf Haar- und Speichelkonzentrationen

Glucocorticosteroide (GC) spielen für viele endogene Prozesse im Organismus eine wichtige Rolle. Sie regulieren die Gluconeogenese sowie den Lipid- und Proteinstoffwechsel. Außerdem sind sie für die Stressregulierung über die Hypothalamus-Nebennierenrinden-Achse verantwortlich. Therapeutisch kommen die GCs wegen ihrer entzündungshemmenden Wirkung zum Einsatz und werden u.a. bei Asthma und Gelenkentzündungen angewandt. Diese Eigenschaft macht sie auch interessant für den Gebrauch im Sportbereich. Dort wird ihre Anwendung über die Weltantidopingagentur reguliert. Ihr oraler, intramuskulärer, intravenöser und rektaler Gebrauch ist im Wettkampf verboten. Diese Einschränkung bzgl. des Applikationszeitraumes und des Applikationsweges erschwert die diagnostische Aussagekraft von Routinedopingproben, welche im Urin durchgeführt werden. Ein Grenzwert von 30 ng/ml soll einen legalen Gebrauch von einem Missbrauch abgrenzen. Die endogenen Glucocorticosteroide stellen hierbei jedoch einen Graubereich dar. Endogen wird Cortisol in einem zirkadianen Rhythmus produziert und die Produktion ist stressinduziert. Somit kommt es zu ausgeprägten intra- und interindividuellen Streuungen der endogenen Produktion. Dadurch bedingt ist eine Abgrenzung der endogenen Produktion von einer legalen Anwendung bzw. einem Missbrauch im Rahmen der Dopingrichtlinien im Urin nicht möglich. Speziell für den Nachweis von endogenen Substanzen ist es wichtig, eine Methode zu finden, mit der es möglich ist, die endogene Produktion von einer exogenen Bezugsquelle abzugrenzen. Dabei haben sich zwei Wege als hilfreich herausgestellt. Zum einen, wenn die Differenzierung nicht an Hand von Absolutkonzentrationen sondern durch die Anwendung von Analytverhältnissen durchgeführt wird. Zum anderen, wenn zusätzliche Untersuchungen im Speichel oder Haar durchgeführt werden. Haar- und Speichelproben zählen zu den ergänzenden Matrizes der Routineuntersuchungsmedien Urin und Blut und werden bereits in vielen forensischen und klinischen Laboren für diagnostische Fragestellungen verwendet. Diese Matrizes liefern wichtige Hinweise auf den akuten (Speichel) oder chronischen/ zurückliegenden (Haar) Gebrauch bzw. Missbrauch von Medikamenten und Drogen. Sowohl die Haar- als auch Speichelmatrix sollen den physiologisch aktiven Anteil von Substanzen im Blut widerspiegeln und somit korrektere Rückschlüsse auf deren Wirksamkeit zulassen. Das endogene Glucocorticosteroid Cortisol steht seit der Jahrtausendwende im Blickpunkt vieler Forschungen, welche sich mit dessen Bedeutung für die Stressantwort befassen und Cortisol u.a. im Speichel und Haar nachweisen. Auffällig ist dabei, dass die ersten Arbeiten fast ausschließlich mittels immunchemischen Nachweisverfahren erfolgten. Erst in den letzten fünf Jahren wurde vermehrt LC-MS/MS-Verfahren angewandt. Vorteil dieser ist, dass der Nachweis von Substanzen selektiv erfolgt und Kreuzreaktionen nicht stattfinden. Weiterhin ist es vorteilhaft, dass die Konzentrationen von mehreren Analyten mit einer Messung bestimmt werden können. So ist es zum Beispiel möglich Cortisol und andere Steroide, z.B. dem Cortison parallel nachzuweisen. Cortison spielt für die physiologische Wirkung der Glucocorticosteroide im Körper keine Rolle, da es selbst nicht biologisch aktiv ist. Deshalb wurde es in bisherigen Forschungen für diagnostische Aussagen nicht berücksichtigt. Mit Verwendung der LC-MS/MS-Technologie werden jedoch beide endogenen GCs zunehmend nebeneinander bestimmt. Bei der Betrachtung von unterschiedlichen Untersuchungsmedien ist auffällig, dass sich die Konzentrationsverhältnisse Cortisol zu Cortison unterscheiden. Entgegengesetzte Verhält-nisse werden ersichtlich, wenn die GC-Konzentrationen im Blut mit denen im Speichel bzw. Haar verglichen werden. Bisher wurden diese Beobachtungen mit der lokalen Wirksamkeit von Enzymen, welche die Corticosteroide ineinander umwandeln, erklärt. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde folgender Fragestellung für die Nachweisbarkeit der Glucocorticosteroide nachgegangen: „Wie hoch ist der Anteil der Plasmaproteinbindung der GCs im Blut und welche Rückschlüsse lassen sich daraus auf die Konzentrationsverschiebung innerhalb der einzelnen Matrizes ziehen?“ Basierend auf die einzelnen Teilprojekte wurden sowohl Plasmaproben als auch Speichel- und Haarproben hinsichtlich ihrer GC-Konzentrationen analysiert. Die Untersuchung von Kontrollproben ermöglichte es, Referenzwerte unter Normalbedingungen zu erheben. Die Ergebnisse aus den Projekten ergaben, dass die beiden endogen GCs Cortisol und Cortison in unterschiedlichen Konzentrationsverhältnissen in den Analysenmedien vorkommen: Plasma: Gesamtkonzentration F:E ca. 3:1 freie Konzentrationen F:E ca. 1:1 Speichel: F:E ca. 1:5 Haar: F:E ca. 1:3 Die Bestimmung der Plasmaproteinbindung (PPB) beider endogener GCs hat gezeigt, dass Cortisol mit ca. 96 % stärker an die Transportproteine CBG und Albumin bindet als Cortison mit ca. 85 %. Dies führt dazu, dass sich die freien, nicht-proteingebundenen Konzentrationen angleichen und es zu einer Verhältnisverschiebung von Cortisol zu Cortison von 3:1 auf 1:1 kommt. Somit stehen vergleichbare Konzentrationen für die Inkorporation ins Haar bzw. die Diffusion in den Speichel zur Verfügung. Es konnte gezeigt werden, dass die freien Plasmakonzentrationen beider GC stark mit den Speichelkonzentrationen korrelieren. Cortisol aber unterproportional und Cortison überproportional vom Plasma in den Speichel übergeht. Dies kann mit zwei weiteren Mechanismen, welche während der Diffusion eine Rolle spielen, der unterschiedlichen Lipophilie und der Inaktivierung durch lokale Enzym-reaktionen, erklärt werden. Weiterhin wurde gezeigt, dass sich die Tagesrhythmik der GC-Produktion im Speichel abbilden lässt und eine starke Korrelation zwischen Cortison und Cortisol vorliegt. Mit Hilfe einer Grenzfunktion können endogene Referenzkonzentrationen definiert und Messdaten eingeordnet werden. Unter anderem wurde gezeigt, dass eine Hormonersatztherapie mit Hydrocortison zu einer Verschiebung der Metabolisierung und der PPB führt und somit ein Gebrauch/Missbrauch von GCs durch abweichende Konzentrationsverhältnisse nachweisbar ist. Speicheluntersuchungen während einer chronischen Stresssituation (Schwangerschaft) zeigen, dass die GC-Produktion stetig ansteigt und sich besonders die morgendlichen Werte unterscheiden. Um die tageszeitlichen und stressbedingten Schwankungen der GC-Produktion auszublenden und eine längere Zeitspanne zu betrachten, wurden zusätzlich Haarproben analysiert. In diesen wurde ein kontinuierlicher Anstieg der GCs in den proximalen Haarsegmenten nachgewiesen, was auf eine kontinuierlich erhöhte Inkorporation während der chronischen Stresssituation schließen lässt. Außerdem wurde gezeigt, dass die Haarkonzentrationen dem Auswascheffekt unterliegen und die nachweisbaren Konzentrationen geringer werden, je älter das Haar wird. Schlussfolgernd kann gesagt werden, dass beide Mechanismen (Einlagerung und Auswaschung) konkurrieren und deshalb Referenzdaten nur für das proximale Segment erhoben werden können. Für weitere Segmente sind die Auswirkungen der individuellen Einflüsse nicht mehr allgemeingültig kalkulierbar und nur noch intraindividuelle Vergleiche nach mehrmaliger Beprobung aussagekräftig. Sind die Effekte der verstärkten Inkorporation größer als die Auswaschung, lassen sich diese auch Monate später erkennen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Plasmaproteinbindung der GCs zur Verhältnisverschiebung der Konzentrationen im Blut, Speichel und Haar beiträgt. Etwa 50 % des beobachteten Effekts kann der PPB zugeordnet werden. Weitere Quellen sind die unterschiedliche Lipophilie der GCs und die enzymatische Umwandlung, welche im Rahmen der vorliegenden Arbeit jedoch nicht „quantitativ“ betrachtet wurden. Die enzymatische Inaktivierung wurde bis dato als Hauptverantwortliche für die Konzentrationsverschiebung diskutiert. Mit der aktuellen Arbeit wurde dies widerlegt, und die Plasmaproteinbindung als Hauptquelle identifiziert

Statistical significance of hair analysis of clenbuterol to discriminate therapeutic use from contamination

Clenbuterol is a well-established 2-agonist, which is prohibited in sports and strictly regulated for use in the livestock industry. During the last few years clenbuterol-positive results in doping controls and in samples from residents or travellers from a high-risk country were suspected to be related the illegal use of clenbuterol for fattening. A sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was developed to detect low clenbuterol residues in hair with a detection limit of 0.02pg/mg. A sub-therapeutic application study and a field study with volunteers, who have a high risk of contamination, were performed. For the application study, a total dosage of 30 mu g clenbuterol was applied to 20 healthy volunteers on 5 subsequent days. One month after the beginning of the application, clenbuterol was detected in the proximal hair segment (0-1cm) in concentrations between 0.43 and 4.76pg/mg. For the second part, samples of 66 Mexican soccer players were analyzed. In 89% of these volunteers, clenbuterol was detectable in their hair at concentrations between 0.02 and 1.90pg/mg. A comparison of both parts showed no statistical difference between sub-therapeutic application and contamination. In contrast, discrimination to a typical abuse of clenbuterol is apparently possible. Due to these findings results of real doping control samples can be evaluated. Copyright (c) 2014 John Wiley & Sons, Ltd

Endocannabinoid concentrations in hair are associated with PTSD symptom severity

Wilker S, Pfeiffer A, Elbert T, et al. Endocannabinoid concentrations in hair are associated with PTSD symptom severity. Psychoneuroendocrinology. 2016;67:198-206