Chromosome breakage after G2 checkpoint release

DNA double-strand break (DSB) repair and checkpoint control represent distinct mechanisms to reduce chromosomal instability. Ataxia telangiectasia (A-T) cells have checkpoint arrest and DSB repair defects. We examine the efficiency and interplay of ATM's G2 checkpoint and repair functions. Artemis cells manifest a repair defect identical and epistatic to A-T but show proficient checkpoint responses. Only a few G2 cells enter mitosis within 4 h after irradiation with 1 Gy but manifest multiple chromosome breaks. Most checkpoint-proficient cells arrest at the G2/M checkpoint, with the length of arrest being dependent on the repair capacity. Strikingly, cells released from checkpoint arrest display one to two chromosome breaks. This represents a major contribution to chromosome breakage. The presence of chromosome breaks in cells released from checkpoint arrest suggests that release occurs before the completion of DSB repair. Strikingly, we show that checkpoint release occurs at a point when approximately three to four premature chromosome condensation breaks and approximately 20 gammaH2AX foci remain

Comparison of methodologies and geostatistical approaches for diagenesis quantification

http://www.searchanddiscovery.com/author.shtml#dInternational audienc

ATM and Artemis promote homologous recombination of radiation-induced DNA double-strand breaks in G2

Homologous recombination (HR) and non‐homologous end joining (NHEJ) represent distinct pathways for repairing DNA double‐strand breaks (DSBs). Previous work implicated Artemis and ATM in an NHEJ‐dependent process, which repairs a defined subset of radiation‐induced DSBs in G1‐phase. Here, we show that in G2, as in G1, NHEJ represents the major DSB‐repair pathway whereas HR is only essential for repair of ∼15% of X‐ or γ‐ray‐induced DSBs. In addition to requiring the known HR proteins, Brca2, Rad51 and Rad54, repair of radiation‐induced DSBs by HR in G2 also involves Artemis and ATM suggesting that they promote NHEJ during G1 but HR during G2. The dependency for ATM for repair is relieved by depleting KAP‐1, providing evidence that HR in G2 repairs heterochromatin‐associated DSBs. Although not core HR proteins, ATM and Artemis are required for efficient formation of single‐stranded DNA and Rad51 foci at radiation‐induced DSBs in G2 with Artemis function requiring its endonuclease activity. We suggest that Artemis endonuclease removes lesions or secondary structures, which inhibit end resection and preclude the completion of HR or NHEJ

CtIP and MRN promote non-homologous end-joining of etoposide-induced DNA double-strand breaks in G1

Topoisomerases class II (topoII) cleave and re-ligate the DNA double helix to allow the passage of an intact DNA strand through it. Chemotherapeutic drugs such as etoposide target topoII, interfere with the normal enzymatic cleavage/re-ligation reaction and create a DNA double-strand break (DSB) with the enzyme covalently bound to the 5′-end of the DNA. Such DSBs are repaired by one of the two major DSB repair pathways, non-homologous end-joining (NHEJ) or homologous recombination. However, prior to repair, the covalently bound topoII needs to be removed from the DNA end, a process requiring the MRX complex and ctp1 in fission yeast. CtIP, the mammalian ortholog of ctp1, is known to promote homologous recombination by resecting DSB ends. Here, we show that human cells arrested in G0/G1 repair etoposide-induced DSBs by NHEJ and, surprisingly, require the MRN complex (the ortholog of MRX) and CtIP. CtIP's function for repairing etoposide-induced DSBs by NHEJ in G0/G1 requires the Thr-847 but not the Ser-327 phosphorylation site, both of which are needed for resection during HR. This finding establishes that CtIP promotes NHEJ of etoposide-induced DSBs during G0/G1 phase with an end-processing function that is distinct to its resection function

γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization

DNA double-strand breaks (DSBs) represent an important radiation-induced lesion and impaired DSB repair provides the best available correlation with radiosensitivity. Physical techniques for monitoring DSB repair require high, non-physiological doses and cannot reliably detect subtle defects. One outcome from extensive research into the DNA damage response is the observation that H2AX, a variant form of the histone H2A, undergoes extensive phosphorylation at the DSB, creating γH2AX foci that can be visualised by immunofluorescence. There is a close correlation between γH2AX foci and DSB numbers and between the rate of foci loss and DSB repair, providing a sensitive assay to monitor DSB repair in individual cells using physiological doses. However, γH2AX formation can occur at single-stranded DNA regions which arise during replication or repair and thus does not solely correlate with DSB formation. Here, we present and discuss evidence that following exposure to ionising radiation, γH2AX foci analysis can provide a sensitive monitor of DSB formation and repair and describe techniques to optimise the analysis. We discuss the limitations and benefits of the technique, enabling the procedure to be optimally exploited but not misused

CtIP and MRN promote non-homologous end-joining of etoposide-induced DNA double-strand breaks in G1

Topoisomerases class II (topoII) cleave and re-ligate the DNA double helix to allow the passage of an intact DNA strand through it. Chemotherapeutic drugs such as etoposide target topoII, interfere with the normal enzymatic cleavage/re-ligation reaction and create a DNA double-strand break (DSB) with the enzyme covalently bound to the 5′-end of the DNA. Such DSBs are repaired by one of the two major DSB repair pathways, non-homologous end-joining (NHEJ) or homologous recombination. However, prior to repair, the covalently bound topoII needs to be removed from the DNA end, a process requiring the MRX complex and ctp1 in fission yeast. CtIP, the mammalian ortholog of ctp1, is known to promote homologous recombination by resecting DSB ends. Here, we show that human cells arrested in G0/G1 repair etoposide-induced DSBs by NHEJ and, surprisingly, require the MRN complex (the ortholog of MRX) and CtIP. CtIP's function for repairing etoposide-induced DSBs by NHEJ in G0/G1 requires the Thr-847 but not the Ser-327 phosphorylation site, both of which are needed for resection during HR. This finding establishes that CtIP promotes NHEJ of etoposide-induced DSBs during G0/G1 phase with an end-processing function that is distinct to its resection function

A fast and robust hepatocyte quantification algorithm including vein processing

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Quantification of different types of cells is often needed for analysis of histological images. In our project, we compute the relative number of proliferating hepatocytes for the evaluation of the regeneration process after partial hepatectomy in normal rat livers.</p> <p>Results</p> <p>Our presented automatic approach for hepatocyte (HC) quantification is suitable for the analysis of an entire digitized histological section given in form of a series of images. It is the main part of an automatic hepatocyte quantification tool that allows for the computation of the ratio between the number of proliferating HC-nuclei and the total number of all HC-nuclei for a series of images in one processing run. The processing pipeline allows us to obtain desired and valuable results for a wide range of images with different properties without additional parameter adjustment. Comparing the obtained segmentation results with a manually retrieved segmentation mask which is considered to be the ground truth, we achieve results with sensitivity above 90% and false positive fraction below 15%.</p> <p>Conclusions</p> <p>The proposed automatic procedure gives results with high sensitivity and low false positive fraction and can be applied to process entire stained sections.</p

Untersuchungen zur Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen in der G2-Phase des Zellzyklus

Diese Arbeit widmet sich der Untersuchung des Beitrags der verfügbaren Wege zur Reparatur von strahlen- und etoposidinduzierten DNA-Schäden in der G2-Phase des Zellzyklus. Hier stehen zwei Hauptreparaturwege zur Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSBs) zur Verfügung. Die Homologe Rekombination (HR) ermöglicht durch Sequenzabgleich mit homologen DNA-Regionen die fehlerfreie Reparatur des DNA-Schadens. Das NHEJ beruht auf der einfachen Verknüpfung von freien DNA-Enden. Die Reparatur erfolgt sehr schnell, allerdings birgt dieser Reparaturweg das Risiko von Mikrodeletionen und verläuft somit nicht zwangsweise fehlerfrei. Die Nuklease Artemis und die Proteinkinase ATM sind für die Reparatur einer Subpopulation strahleninduzierter DNA-Schäden von Bedeutung. Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit dem Einfluss von heterozygoten Mutationen der DNA-Reparaturfaktoren BRCA1 und BRCA2, die mit einer erblichen Prädisposition für Brustkrebs in Verbindung gebracht werden. Die Untersuchung des Reparaturvermögens stationärer BRCA1- bzw. BRCA2-Mutanten konnte keine Einschränkung der DNA-Reparatur nach ionisierender Bestrahlung (IR) nachweisen. Dieses Ergebnis wurde durch die Analyse von G1-Phase-Zellen einer exponentiell wachsenden Kultur bestätigt. Auch in der G2-Phase hat eine heterozygote Mutation in BRCA1 keinen Einfluss auf die Reparaturkapazität der betroffenen Zellen. Die Aktivität des vorhandenen Restproteins scheint für eine vollständige Reparatur auszureichen. Dagegen führt eine heterozygote Mutation in BRCA2 zu einer Verminderung der DSB-Reparatur in der G2-Phase und resultiert in einem Defekt der langsamen Reparaturkomponente. Allerdings zeigen die untersuchten Mutanten trotz identischer Mutationen ein sehr heterogenes Reparaturverhalten, was einen Einfluss des genetischen Hintergrunds nahe legt. Aufgrund der geringen Kohortengröße der untersuchten Zelllinien und der in der Literatur kontrovers diskutierten Situation ist eine Beurteilung des Einflusses heterozygoter Mutationen in BRCA1 bzw. BRCA2 auf Basis der durchgeführten Experimente nicht abschließend möglich. Die Charakterisierung der homozygot defekten BRCA2-Mutante konnte eine Beteiligung der HR an der Reparatur strahleninduzierter DSBs in der G2-Phase nachweisen. Defekte in der HR betreffen ebenso wie Defizienzen in ATM und Artemis die langsame Komponente der Reparatur. Die Ähnlichkeiten in Verlauf der Reparaturkinetik und im Ausmaß des Reparaturdefekts von BRCA2-, ATM- und Artemis-defizienten Zellen eröffnet die Möglichkeit der Beteiligung dieser Reparaturfaktoren an einem gemeinsamen Reparaturweg. Epistasisanalysen mit einem spezifischen ATM-Inhibitor bestätigen diese Vermutung. BRCA2 ist ein etablierter HR-Faktor, wodurch ATM und Artemis in der G2-Phase mit der HR in Zusammenhang gebracht werden. Dieses Ergebnis ist sehr überraschend, da die ATM/Artemis-abhängige Reparatur in G1 als Unterweg des DNA-PK-abhängigen NHEJ betrachtet wird. Dagegen verläuft die Reparatur dieser Schäden in der G2-Phase unabhängig von funktionaler DNA-PK über den Reparaturweg der HR, wie durch Epistasisanalysen mit einem Inhibitor der DNA-PKcs gezeigt werden konnte. Somit wird der Großteil der IR induzierten DSBs sowohl in G1 wie auch in G2 durch die schnelle Komponente des NHEJ repariert. Die Reparaturfaktoren ATM und Artemis werden für die langsame Reparatur einer Subfraktion der strahleninduzierten DSBs benötigt. Diese werden in der G1-Phase unter Beteiligung funktionaler DNA-PK über NHEJ repariert, während die Reparatur in G2 DNA-PK-unabhängig durch HR fortgeführt wird. Der Heterochromatinanteil in humanen Zellen korreliert sehr gut mit dem Ausmaß der ATM/Artemis-abhängigen Reparatur. Dies könnte darauf hindeuten, dass heterochromatinassoziierte DSBs aufgrund ihrer Lokalisation zur erfolgreichen Reparatur ATM und Artemis benötigen. Die Funktion von ATM könnte in der Auflösung der dichtgepackten Heterochromatinstruktur liegen, wurde jedoch in dieser Arbeit nicht weiter untersucht. Die Rolle von Artemis wurde in Komplementationsexperimenten mit verschiedenen Artemis-Konstrukten charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Endonukleasefunktion von Artemis für eine vollständige Reparatur unabdingbar ist. Die Tatsache, dass etoposidinduzierte DNA-Schäden eine deutlich geringere Beteiligung von ATM und Artemis zeigen, deutet darauf hin, dass auch die Komplexität eines DNA-Schadens Einfluss auf die Reparatur hat. Chemisch induzierte DSBs weisen eine einheitliche, unkomplizierte Struktur auf und können aus diesem Grund ohne Beteiligung von ATM und Artemis auch im Heterochromatin durch NHEJ repariert werden. Dagegen könnte bei IR-induzierten DNA-Schäden die Struktur der DSBs in Kombination mit der Lokalisation des Bruchs die Abhängigkeit von ATM und Artemis bedingen. Sowohl die Lokalisation des DSBs im Heterochromatin wie auch die Komplexität eines DSBs führen zu einer Verzögerung der Reparatur. Möglicherweise entstehen während dieser Zeit, die der DSB in unrepariertem Zustand verbleibt, sekundäre Strukturen, die durch Artemis bearbeitet werden müssen. Nach der Bearbeitung durch ATM und Artemis werden die entsprechenden DNA-Schäden in G2 der HR zugeführt. Dies deutet darauf hin, dass diese Strukturen in frühen Bearbeitungsschritten der HR enstehen, unbearbeitet die Reparatur verhindern und den Bruch für die HR markieren. In der G1-Phase, in der keine HR zur Verfügung steht, müssen diese DNA-Schäden unter Beteiligung der DNA-PK über NHEJ repariert werden, während DNA-PK die Reparatur der anderen durch NHEJ reparierten DNA-Schäden lediglich erleichtert. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die Reparatur von etoposidinduzierten, kovalent verknüpften DNA-Protein-Komplexen untersucht. Die Ergebnisse zeigen eine direkte Beteiligung des MRN-Komplexes an der Reparatur dieser DNA-Schäden in der G1-Phase. Dabei ist vermutlich die Endonukleaseaktivität des Proteinkomplexes für die Entfernung des verknüpften Proteins mitsamt eines kurzen DNA-Fragments verantwortlich. Die entstehenden freien Enden können anschließend durch NHEJ verknüpft werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte Einblick in das komplexe Zusammenspiel der unterschiedlichen Reparaturwege in der G2-Phase des Zellzyklus gewonnen werden. Der Beitrag der HR zur Reparatur von DNA-Schäden konnte quantifiziert und der langsamen Komponente der Reparatur zugeordnet werden. Diese ist für die ATM/Artemis-abhängige Reparatur von DNA-Schäden zuständig, die in G1 durch DNA-PK-abhängiges NHEJ repariert werden, während in G2 die HR angeschlossen wird. Über die Faktoren, die den Bedarf an ATM und Artemis bedingen, konnten nur Vermutungen angestellt werden. Diese Aspekte sind allerdings noch nicht vollständig verstanden und sollten in zukünftigen Arbeiten weiter untersucht werden

Elevated radiation-induced γH2AX foci in G2 phase heterozygous BRCA2 fibroblasts.

BACKGROUND AND PURPOSE: About 5-10% of all breast cancer cases are associated with heterozygous germ-line mutations in the genes encoding BRCA1 and BRCA2. Carriers of such mutations are highly predisposed for developing breast or ovarian cancer and, thus, are advised to undergo regular radio-diagnostic examinations. BRCA1 and BRCA2 are involved in multiple cellular processes including the repair of ionizing radiation (IR)-induced DNA double-strand breaks (DSBs) and different studies addressing the DSB repair capacity of BRCA1+/- or BRCA2+/- cells led to contradictory results. MATERIALS AND METHODS: Using the sensitive method of γH2AX foci analysis in combination with cell cycle markers, we specifically measured DSB repair in confluent G0 as well as in exponentially growing G1 and G2 phase primary WT, BRCA1+/- and BRCA2+/- fibroblasts. RESULTS: Both BRCA1+/- and BRCA2+/- cells displayed normal DSB repair in G0 and in G1. In contrast, in G2, BRCA2+/- but not BRCA1+/- cells exhibited a decreased DSB repair capacity which was in between that of WT and that of a hypomorphic BRCA2-/- cell line. CONCLUSIONS: The residual amount of normal BRCA1 seems to be sufficient for efficient DSB repair in all cell cycle phases, while the decreased DSB repair capacity of heterozygous BRCA2 mutations suggests gene dosage effects in G2