2 research outputs found
Rationale, design, and methods of a non-interventional study to establish safety, effectiveness, quality of life, cognition, health-related and work capacity data on Alemtuzumab in multiple sclerosis patients in Germany (TREAT-MS)
Überexpression und Charakterisierung des extrazellulären Teils der humanen alpha-Sekretase ADAM10
„ÜBEREXPRESSION UND CHARAKTERISIERUNG DES
EXTRAZELLULĂ„REN TEILS
DER HUMANEN alpha-SEKRETASE ADAM10“
ALEXANDRA LEPTICH
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei enzymatisch aktive lösliche Proteinvarianten der humanen
alpha-Sekretase ADAM10 in Insektenzellen exprimiert, gereinigt und charakterisiert. Dabei entsprach eine
der löslichen ADAM10-Varianten dem extrazellulären Bereich des Typ-I-Membranproteins, d.h. ihr
fehlte die Transmembran- und cytoplasmatische Domäne. Die zweite Variante stimmt mit einer im
menschlichen Gehirn auf mRNA-Ebene nachgewiesenen Splicevariante überein, die zusätzlich noch
durch das Fehlen der Cystein-reichen Domäne gekennzeichnet ist. Die alpha-Sekretase ADAM10 spielt
eine wichtige Rolle bei der nicht-amyloidogenen Prozessierung des Amyloid-Vorläufer-Proteins
(APP). Dabei erfolgt dessen Spaltung innerhalb der beta-Amyloidsequenz, so dass die Produktion von
Abeta-Peptiden und damit die Bildung von Amyloid-Plaques während der Alzheimer’schen Erkrankung
verhindert wird.
Nach der Expression
der beiden löslichen ADAM10-Proteine in Insektenzellen erfolgte die
Reinigung der prozessierten und damit reifen Enzymform der jeweiligen ADAM10-Proteinvariante
mittels Lektin-Affinitätschromatographie.
Die anschließende Charakterisierung der beiden löslichen ADAM10-Proteine erfolgte durch
einen auf HPLC-Analyse basierenden Enzymtest. Dabei wurden verschiedene sich von der
beta-Amyloid-Sequenz ableitenden Peptidsubstrate in vitro eingesetzt, die zum einen den Aminosäuren
11-28 der Abeta-Sequenz, zum anderen dem kompletten Abeta40-Peptid entsprachen und damit die
charakteristische alpha-Sekretasespaltstelle des Amyloid-Vorläufer-Proteins enthielten. Des Weiteren
kamen jeweils entsprechende Peptidsubstrate zum Einsatz, die an den Positionen 21 und 22 der Abeta-
Peptidsequenz vorkommenden Mutationen trugen.
Die gewählten Abeta-Substrate konnten durch die löslichen Varianten der alpha-Sekretase ADAM10 an
der alpha-Sekretasestelle gespalten werden. Dabei konnte bei den Abeta11-28-
Peptiden deutlich die in der
Literatur beschriebene Abhängigkeit der Spaltung von der a-helicalen Struktur des Substrats
beobachtet werden, während bei den längeren Abeta40-Peptide diesbezüglich kein Zusammenhang
hergestellt werden konnte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ADAM10 hauptsächlich als
alpha-Sekretase wirkt, weniger als ein Abeta-degradierendes Enzym. Ferner konnte unter Verwendung
entsprechender muriner und humaner Abeta-Peptide eine verstärkte Spaltung der murinen Substrate
Abeta1-28 und Abeta1-40 durch den extrazellulären Teil von ADAM10 in vitro gezeigt werden. Dieser
Versuch bestätigt die Annahme, dass es bei Nagetieren durch die Bevorzugung der nichtamyloidogenen
Prozessierung von APP durch die alpha-Sekretase ADAM10 zu keiner Bildung von
Amyloid-Plaques kommt. Ein Einfluss auf die Spaltung von membrangebundenem APP und damit der
Bildung von neuroprotektivem sAPPalpha durch die löslichen ADAM10-Proteine konnte im Zellsystem
nicht beobachtet werden.
Vielmehr scheint hier die Membranverankerung von Enzym und Substrat
eine wichtige Voraussetzung zu bilden. Des Weiteren konnten die löslichen ADAM10-Proteine durch
ein fĂĽr die Inhibierung von ADAM10 spezifische Hydroxamat-Derivat in ihrer enzymatischen
Aktivität gehemmt werden.
Die exprimierten ADAM10-Proteine weisen die charakteristischen Eigenschaften der alpha-Sekretase
ADAM10 auf, wobei deutlich wurde, dass das Fehlen der Cystein-reichen Domäne keinen Einfluss
auf die Fähigkeit der katalytischen Domäne zur Substrat- und Inhibitorbindung hatte. Auch die
Stabilität des Enzyms wurde durch das Fehlen der Domäne nicht negativ beeinträchtigt.
Eine wichtige Aufgabe stellt nun der Nachweis der löslichen ADAM10-Proteine sowie die
Identifizierung ihrer potentiellen Substrate und deren Lokalisation in vivo dar.„OVEREXPRESSION UND CHARACTERISATION OF THE EXTRAZELLULAR DOMAIN
OF THE HUMAN alpha-SEKRETASE ADAM10“
ALEXANDRA LEPTICH
In this work, two enzymatic active soluble protein variants of the human alpha-secretase ADAM10
were expressed, purified und characterised. One of the soluble ADAM10 variant corresponds to the
extracellular domain of the type-I-membrane protein that is without the transmembrane- and the
cytoplasmatic domain. The second enzyme corresponds to a splice-variant of ADAM10 detected on
mRNA-level in human brain. This enzyme also lacks the cysteine-rich domain. The alpha-secretase
ADAM10 plays an important role in the non-amyloidogenic processing of the amyloid precursor
protein (APP). The APP is cleaved by the alpha-secretase within the beta-amyloid sequence so that
the
production of Abeta-peptides and the following building of amyloid-plaques during Alzheimer disease is
prevented.
After expression both ADAM10-peptides in insect cells the purification of the processed and
therefore mature forms of the particular variant of the ADAM10 protein was carried out through lectin
affinity chromatography.
The characterisation of both soluble ADAM10 proteins is raised by a HPLC-analyse based
enzyme-assay. For these in vitro assays different peptides derived from the beta-amyloid sequence were
used. The peptides correspond to the amino acids 11 to 28 of the Abeta-sequence and the complete
Abeta40-peptide respectively and so contain the specific cleavage-site of the alpha-secretase inside the
amyloid precursor protein. Furthermore peptides with mutations at position 21 and 22 of the Abeta
peptide sequence were used.
The chosen Abeta substrates were cleaved at the alpha-secretase cleavage-site by the soluble variants of
the alpha-secretase
ADAM10. Thereby it could be recognised that the cleavage of the Abeta11-28 peptides
depend on alpha-helical structure of the substrate as described in literature. On the cleavage of the Abeta40-
peptides this dependence could not be observed. These results point out that ADAM10 principally acts
as alpha-secretase instead of an Abeta degrading enzyme. Furthermore there was an increased cleavage of
murine Abeta1-28 and Abeta1-40 by the extracellular domain of ADAM10 compared to that of the human
substrates in vitro. These results confirm that because of the activity of the alpha-secretase ADAM10 and
therefore the preference of the not-amyloidogenic processing of APP rodents do not build amyloidplaques.
There was no influence on the cleavage of membrane bound APP and therefore the building
of neuroprotective sAPPalpha due to soluble ADAM10 proteins in the chosen cell system observed. In
fact it seems that the cleavage depends on the membrane-bound forms of enzyme and substrate. In
naddition the soluble ADAM10 proteins could be inhibited with an ADAM10 specific inhibitor.
The expressed ADAM10 proteins show the characteristic properties of the alpha-secretase. Here, the
lack of the cysteine-rich domain did not influence the substrate and inhibitor binding abilities of the
catalytic domain. The absent domain had also no negative effect on the stability of the enzyme.
An important challenge will be the detection of soluble ADAM10 proteins as well as the
identification of potential substrates and their localisation in vivo