Estudo comparativo das toxinas PnTx2-5 e PnTx2-6 sobre canais de sódio

Exportado OPUSMade available in DSpace on 2019-08-12T21:44:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 td_alessandramatavel.pdf: 1755215 bytes, checksum: 8e0b2a9c7b99aa205327debfed99d290 (MD5) Previous issue date: 14A aranha Phoneutria nigriventer é uma das principais responsáveis por acidentes de araneismo na região sudeste do Brasil. Os sintomas predominantes causados por sua peçonha resultam em hiperexcitabilidade geral. Duas toxinas presentes no veneno, a Pntx2-5 e a PnTx2-6 possuem 48 resíduos de aminoácidos cada, com peso molecular de 5112,3 e 5289,3 Da, respectivamente. A toxina PnTx2-6 foi considerada o componente mais tóxico do veneno da aranha, por apresentar efeitos similares aos do veneno total, modificando os canais de sódio. Por se diferirem em apenas cinco resíduos de aminoácidos, comparamos os efeitos das toxinas PnTx2-5 e PnTx2-6 em canais de sódio de células GH3, alem de comparar os efeitos da PnTx2-6 em canais de sódio de diferentes tipos celulares (neuronal e muscular esquelético). Nossos dados mostram que ambas as toxinas aumentam a constante de tempo para a inativação dos canais de sódio em todas as preparações estudadas, com o surgimento de um componente que não inativa. Além disso, em músculo esquelético de rã, a PnTx2-6 reduz a amplitude da corrente de sódio, desloca as curvas de ativação e estado estacionário da inativação para valores hiperpolarizados e aumenta o tempo necessário para a recuperação da corrente de sódio. A afinidade da PnTx2-6 em sarcolema de rã foi 25 vezes menor que em células GH3. Nessas células, a PnTx2-6 modificou os parâmetros relacionados à inativação dos canais de sódio (a curva do estado estacionário da inativação e a recuperação da inativação da corrente de sódio) e o tempo para o pico da corrente. A PnTx2-5 modificou a curva de inativação no estado estacionário, mas não modificou o tempo para o pico e a recuperação da corrente de sódio. As toxinas da aranha não alteram a amplitude da corrente de sódio em células GH3. Uma diferença que nos chamou a atenção entre a PnTx2-6 e a PnTx2-5 em células GH3 foi a diferença em suas afinidades: o K0,5 da PnTx2-6 é 3 vezes menor que da PnTx2-5. Além disso, a PnTx2-5 se liga de forma reversível, sendo lavada do seu sítio ativo. Quando a célula é fortemente despolarizada esta toxina se desliga mais rápido. A PnTx2-6 não se deslocou do seu sítio ativo em nossas condições experimentais, nem mesmo com fortes despolarizações. A análise do dicroísmo circular da Pntx2-6 sugere que ela seja formada predominantemente por folhas- e estrutura randômica, apresentando baixa proporção de -hélice. O espectro de fluorescência do triptofano mostrou que estes resíduos estão expostos na superfície da molécula. Visto que um triptofano e uma tirosina estão substituídos na PnTx2-5, estes aminoácidos podem estar envolvidos na ligação da toxina ao canal de sódio, sendo importantes para conferir o maior K0,5 desta toxina quando comparada à PnTx2-6.The spider Phoneutria nigriventer is the major responsible for the araneism accidents in the Southeast of Brazil. The predominant symptoms of the envenomation indicate a general hyperexcitability. Two toxins of the venom, PnTx2-5 and PnTx2-6 have 48 amino acids each, and molecular weight 5112.3 e 5289.3 Da, respectively. The toxin PnTx2-6 is the most toxic component of the spider venom, and produces similar effects of the whole venom, modifying the sodium channels. As PnTx2-5 and PnTx2-6 diverge in 5 amino acids, we compared their effects on the sodium channel currents of GH3 cells, and compared the effects of PnTx2-6 on sodium currents of neuronal and skeletal muscle fibers. The data show that both toxins increase the time constant of inactivation of sodium current in all preparation tested, and produce a non-inactivating component. Additionally, in frog skeletal muscle PnTx2-6 decreases the sodium channel current amplitude, shifts the activation and steady-state inactivation voltage dependences to hyperpolarized potentials, and increases the time for recovery from inactivation. The PnTx2-6 affinity in skeletal muscle is 25 times lesser than that of GH3 cells. In these cells, PnTx2-6 modified the parameters related to the inactivation of sodium channels (the voltage-dependence of steady-state inactivation curve and the recovery from the sodium current), and the time to peak of the current as well. PnTx2-5 modifies the steady state inactivation curve, but does not modify the time to peak nor the recovery from inactivation of the sodium current. The toxins do not modify the amplitude of the sodium channel in GH3 cells. The main difference PnTx2-6 and PnTx2-5 on GH3 cells was their affinities: the K0,5 of PnTx2-6 is 3 times smaller than PnTx2-5. In addition, PnTx2-5 binds reversibly and can be washed from its binding site. When the cell is strongly depolarized, this toxin unbind faster, However, PnTx2-6 is not displaced from its binding site in ours experimental condition, even after strong depolarization The circular dichroism analysis of Pntx2-6 suggests that its secondary structure is formed predominantly by -sheet and random coil, with a small proportion -helix. The tryptophan fluorescence spectra show that these residues are exposed on PnTx2-6. One tryptophan and one tyrosine are replaced in PnTx2-5 when compared to PnTx2-6, and these amino acids may be involved in the binding of the toxin to the sodium channel, and their absence may account for the difference of affinities

Tx2-6, uma toxina da aranha Phoneutria nigriventer que modifica os canais de Na+ sensíveis à voltagem

Exportado OPUSMade available in DSpace on 2019-08-14T18:23:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao1999alessandramatavel_ve.pdf: 1891292 bytes, checksum: cc7438037db7feaedb5b7a268edab838 (MD5) Previous issue date: 11Muitos organismos produzem polipeptídeos com atividade tóxica sobre outros organismos. Os canais de sódio dependentes de voltagem são os principais alvos de muitas toxinas estudadas até o momento. Dois sítios de ligação específicos de toxinas polipeptídicas têm sido particularmente caracterizados sobre o canal de sódio. Toxinas que se ligam ao sítio 3 causam ativação persistente do canal de sódio por inibir sua inativação. Toxinas que se ligam ao sítio 4 deslocam a dependência de voltagem da ativação para potenciais mais negativos. A toxina Tx2-6, obtida da fração PhTx2 do veneno da aranha brasileira Phoneutria nigriventer, é um peptídeo básico que apresenta 48 resíduos de aminoácidos, rico em cisteínas. Este peptídeo é muito tóxico para camundongos e reproduz os principais sintomas do veneno total. A proposta deste estudo é a caracterização do efeito da Tx2-6 sobre os canais de sódio de músculo esquelético de rã, utilizando a técnica modificada do loose patch clamp como método para o estudo das correntes de sódio macroscópicas. Nossos resultados mostram que a Tx2-6 modifica a cinética dos canais de sódio de maneira dose-dependente. A Tx2-6 na concentração de 1 ìM prolonga a constante de tempo da inativação e desloca a dependência de voltagem da ativação e da inativação para valores mais negativos (-7,4 e -10 mV, respectivamente). A toxina também diminui o potencial de reversão em 10 mV e reduz o pico da corrente de sódio em 48%. No entanto, a toxina não mostrou nenhum efeito sobre a recuperação da inativação ou sobre a desativação da corrente de sódio. Estas complexas alterações podem explicar o efeito tóxico da Tx2-6.Esta toxina apresentou pouca identidade na sequência primária com toxinas que atuam nos sítios 3 e 4 dos canais de sódio.Many organisms produce polypeptides with toxic activity against other organisms. The voltage-gated sodium channels are the main targets of many toxins studied so far. Two specific binding sites of polypeptide toxins have been particularly characterized on the sodium channels. Toxins which bind to the site 3 cause persistent activation of sodium channel by inhibiting the inactivation. Toxins which bind to the site 4 shift the voltage dependence of activation to more negative potentials. The toxin Tx2-6, obtained from PhTx2 fraction of the Brazilian Phoneutria nigriventer spider venom, is a basic peptide that features 48 amino acids, rich in cysteines. This peptide is very toxic to mice and reproduces the predominant symptoms produced by the whole venom. The purpose of this study is to characterize the effect of Tx2-6 on the sodium channels of frog skeletal muscle, using the modified technique of loose patch clamp as a method for the study of the macroscopic sodium currents. Our results show that the Tx2-6 modifies the kinetics of sodium channels in a dose-dependent manner. The Tx2-6 at 1 ìm prolongs the inactivation time constant and shifts the voltage dependence of both activation and steady-state inactivation to more negative values ( -7.4 and -10 mV, respectively). The toxin also decreases the potential for reversal in 10 mV and reduces the sodium current peak by 48%. However, the toxin showed no effect on recovery from inactivation or the deactivation of the sodium current. Together, these complex changes can explain the toxic effect of Tx2-6. This toxin shows little primary sequence identity with toxins that acts on site 3 and 4 of the sodium channels

Toxinas de serpentes: protótipos de fármacos & patentes? / Snakes toxins: drug design & patents?

As peçonhas de serpentes são uma mistura complexa de componentes proteicos e não-proteicos, cujas proteínas e peptídeos correspondem de 90-95% da peçonha. O vasto arsenal bioquímico presente nessas peçonhas possui moléculas que podem afetar diversas funções biológicas, com grande especificidade e seletividade, em diferentes alvos farmacológicos (receptores, canais iônicos, enzimas). Como resultado, essas moléculas têm sido cada vez mais utilizadas como protótipos para o desenvolvimento de fármacos e medicamentos. Como exemplo, o Captopril® é um  medicamento modelado a partir de um peptídeo  isolado da peçonha da serpente Bothrops jararaca e está no mercado há mais de 30 anos, com administração clínica como  anti-hipertensivo. Desde a década de 1980, a indústria farmacêutica ocidental introduziu produtos farmacêuticos derivados de produtos naturais, mostrando como é promissora a exploração da biodiversidade na prospecção de novos  medicamentos. No presente estudo foi realizada uma busca em bancos de patentes  incluindo peçonhas/ toxinas de serpentes como principal componente em bases de dados nacional (INPI), referente a todo acervo,  e internacional (Espacenet, Google Patents) depositados entre  2014 e 2019. Nossos resultados mostraram que o número de produtos brasileiros  registrados/arquivados tendo peçonhas ou toxinas de serpentes como principais componentes foi mínimo em comparação com as publicações internacionais. A falta de publicações científicas na área de inovação tecnológica em produtos derivados de venenos ou toxinas de serpentes aplicados à indústria farmacêutica revela uma lacuna que os pesquisadores brasileiros precisam preencher por meio da bioprospecção de fármacos como protótipos de produtos de animais com potencial biotecnológico

Use of a purified and functional recombinant calcium-channel β4 subunit in surface-plasmon resonance studies

International audienceNative high-voltage-gated calcium channels are multi-subunit complexes comprising a pore-forming subunit Cav and at least two auxiliary subunits α2δ and β. The β subunit facilitates cell-surface expression of the channel and contributes significantly to its biophysical properties. In spite of its importance, detailed structural and functional studies are hampered by the limited availability of native β subunit. Here, we report the purification of a recombinant calcium-channel β4 subunit from bacterial extracts by using a polyhistidine tag. The purified protein is fully functional since it binds on the alpha1 interaction domain, its main Cav-binding site, and regulates the activity of P/Q calcium channel expressed in Xenopus oocytes in a similar way to the β4 subunit produced by cRNA injection. We took advantage of the functionality of the purified material to (i) develop an efficient surface-plasmon resonance assay of the interaction between two calcium channel subunits and (ii) measure, for the first time, the affinity of the recombinant His-β4 subunit for the full-length Cav2.1 channel. The availability of this purified material and the development of a surface-plasmon resonance assay opens two immediate research perspectives: (i) drug screening programmes applied to the Cav/β interaction and (ii) crystallographic studies of the calcium-channel β4 subunit

Epidemiology of arthropods envenomation in Brazil: a public health issue

Abstract Brazil is located between the Equator and Tropic of Capricorn, which allows diverse climates, reliefs, and habitats for arthropods, which sting represents a risk to human health and a public health issue. This manuscript updates the epidemiological data of cases of human envenoming by spiders, scorpions, and insects with medical relevance in Brazil from 2010 to 2021. Epidemiological data were taken using the Brazilian Notifiable Diseases Information System. Statistics of non-parametric data used the Kruskal-Wallis followed by the Nemenyi test. On average, more than 145,000 envenomation and 145 deaths are recorded annually, and more than 60% of deaths are caused by scorpion bites. When the number of deaths was pondered by the number of cases with each arthropod, bees kill the most. Most stings cause mild symptoms and affect men of working age. The incidence decreases during the colder months, which is better noticeable in regions with well-defined seasons. The distribution is distinct among the regions: Southeast, Northeast, and South have the highest rate of bites. The growing number of cases of envenomation reported annually is a serious public health concern, especially involving scorpions, and highlights the importance of studying arthropod venom and improving the therapies