Fusarium graminearum'un mitokondrisinde bulunan cox3'ün karakterizasyonu

Sitokrom c oksidaz (kompleks IV) mitokondride bulunan büyük bir transmembran proteinidir ve ETZ’ndeki son elektron alıcısıdır. Enzim ETZ’nde oksidasyonla açığa çıkan elektronların moleküler oksijene aktarılmasından sorumludur. Heteromultimerik enzimde bakterilerle paylaşılan üç alt birimden biri cox3 geninin ürünü olan COIII alt birimidir. Diğer iki alt birimden farklı olarak işlevi henüz tam olarak aydınlatılmamıştır. Bu çalışmada cox3 geninin karakterizasyonu bitki patojenlerinden Fusarium graminearum’da gerçekleştirildi. Bu amaçla Türkiye ve İran’dan örneklenmiş, morfolojik ve genetik özelliklerine göre tanımlanmış 45 adet izolatın mitokondri DNA’sı izole edildi. Biyoinformatik araçlar kullanılarak tasarlanan özgün primer çifti ile cox3 gen bölgesi polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltıldı. 527 bç’lik çoğaltım ürünü 39 izolattan elde edildi. Çoğaltım ürünleri saflaştırıldıktan sonra nükleotid dizi bilgisi Sanger yöntemi ile belirlendi. Nukleotid dizilimleri CLUSTALW programı kullanılarak hizalandı. İzolatlar arasındaki ilişki BLASTN analizi ile belirlendi. Gen üzerindeki nükleotid değişimlerinin okunma çerçevesinde neden olduğu değişimler ORF FINDER programı ile belirlendi. 26 izolatta cox3 geninin ORF’sinin (135-372 bç) farklı boyutta (37-123 amino asit) polipeptid zincir sentezi için şifre taşıdığı belirlendi. Tek nükleotid polimorfizmleri ve delesyonların cox3 genindeki yaygın varyasyonlar olduğu ve çerçeve kaymasına yol açarak farklı polipeptidlerin sentezine neden olduğu gösterildi. Elde edilen bulgular tür içinde divergensin ve bireyler arasındaki filogenetik ilişkinin belirlenmesine katkı sağladı. Çalışma F. graminearum’da ilk defa cox3 geninin karakterizasyonunun yapılması ve populasyon yapısı hakkında bilgi sağlaması bakımından büyük önem taşımaktadır. Yapılacak ileri analizler bu değişimlerin farklı işlevli polimorfik protein alt birimlerinin sentezlenmesine mi ya da işlevsel olmayan ürünlerin birikimine mi yol açacağını ortaya koyması bakımından da önemli olacaktır

Geneticin (G418) resistance and electroporation-mediated transformation of Fusarium graminearum and F. culmorum

Fusarium graminearum and F. culmorum are phytopathogenic species causing scab and root rot diseases in all small grain cereals worldwide including Turkey. In this study, resistance levels to geneticin (G418) of 14 F. graminearum and 24 F. culmorum isolates collected from cereals were determined. Fungal cultures were grown on potato dextrose agar medium supplemented with 0, 25, 50, 75 and 100 mu g/mL of G418. Minimum inhibitory concentration was determined as 25 mu g/mL. As a result, it was concluded that all isolates were highly sensitive to G418. Plasmid pFA6-kanmx4 containing geneticin resistance gene (kanmx) was introduced singly or co-electroporated with pEGFP75 plasmid, containing GFP gene, into fungal protoplast cultures obtained with lytic enzyme. Transformants were grown in media including 25 mu g/mL G418. Transformation frequencies were 2.8 and 1.8 transformant per mu g plasmid for F. graminearum and F. culmorum isolates, respectively. Transformation process was also confirmed by spectrofluorimetric assay. Relative fluorescence unit values in co-transformants were calculated as 1.87 +/- 0.04 for F. graminearum and 2.26 +/- 0.08 for F. culmorum. The results obtained from the study gave information about antibiotic resistance levels of two Fusarium species in Turkey. Moreover, it was shown that pFA6-kanmx4 plasmid was a suitable vector, which can be used in genetic manipulation studies of these two fungal species in particular suppression of endogenous and/or the expression of exogenous genes