Hybridation génomique comparative sur puces à ADN (mise en place de la CGH-array dans la stratégie diagnostique des malformations fœtales et des anomalies cytogénétiques prénatales)

L'hybridation génomique comparative sur puces à ADN (CGH-array) est devenue une méthode de choix pour le dépistage des microremaniements chromosomiques. La CGH-array offre, en effet, une étude globale du génome avec une bien meilleure résolution que les méthodes de cytogénétiques conventionnelles . Cette analyse pourrait s'intégrer à la stratégie d'exploration diagnostique des syndromes malformatifs fœtaux inexpliqués. Nous avons donc mis au point cette technique sur quatre types d'échantillons : villosités choriales, liquides amniotiques, cellules en culture de liquides amniotiques et sangs fœtaux. Nous avons étudié 18 cas prénataux. Parmi ceux-ci, nous avons identifié 7 déséquilibres additionnels au caryotype chez 5 fœtus. 3 anomalies sur 7 ont été considérées pathogènes. Le diagnostic moléculaire des anomalies fœtales ayant abouti à une IMG est indispensable. L'utilisation de la CGH-array pour les cas ne justifiant pas une IMG est délicate à cause de la présence de polymorphismes de signification indéterminée. Néanmoins, cette technique devrait, à l'avenir, pouvoir être mise en place en routine pour le diagnostic prénatal dans des cas ciblés, avec une grande prudence face aux anomalies non décrites.NANTES-BU Médecine pharmacie (441092101) / SudocSudocFranceF

Etude de la syntaxine 8 humaine (caractérisation génomique et relations fonctionnelles avec CFTR)

Le gène codant pour la syntaxine 8 humaine (Syn8), une protéine t-SNARE, a été clonée par un criblage double-hybride en utilisant le domaine R de CFTR comme appât. STX8 est morcelé en 8 exons, sur un minimum de 350 kpb, en 17p12. Nous avons localisé un point d'initiation de la transcription, compatible avec la taille de l'ARNm (1,4 kb). La région promotrice a été clonée puis son activité a été évaluée. Par biochimie, nous avons montré une interaction faible entre Syn8 et CFTR puis confirmé leur présence au sein d'un même complexe. Nous avons observé que la surexpression de Syn8 provoquait une inhibition de l'activité de CFTR, qui n'est plus localisé à la membrane plasmique, mais se est concentré dans les endosomes du recyclage. Nos résultats montrent que Syn8 participe au transport et à la régulation de CFTR. Ces informations permettront de préciser les mécanismes du transport intracellulaire de CFTR qui est perturbé chez la plupart des sujets atteints de mucoviscidose.Syntaxin 8, a new t-SNARE protein, was previously cloned with the two hybrid system using the R domain of CFTR as a bait. The human STX8 gene is composed of 8 exons spanning a 350 kb genomic DNA region on chromosome 17. A transcription start was found concordant with the mRNA size (1.4 kb). The promoter region was cloned and its activity was characterized. Biochemical experiments exhibited a weak interaction between CFTR and syntaxin 8 but confirmed that they belonged to a same complex. Syntaxin 8 overexpression led to a strong inhibition of CFTR activity. Indeed CFTR was not localized on plasma membrane but was accumulated in recycling endosomes. Our results show that syntaxin 8 participates directly to CFTR transport and regulates its chloride channel activity. These data could bring some new clues to precise the different steps of CFTR transport, between the endoplasmic reticulum to the plasma membrane, which is disrupted in most of cystic fibrosis patient.POITIERS-BU Sciences (861942102) / SudocSudocFranceF

Caractérisation de deux gènes issus d'une banque soustractive d'ADNc, codant pour la sous-unité S9 du protéasome et pour le lysozyme (Analyse de leur profil d'expression au cours de la progression de la leucémie myéloïde chronique par Northern et RT-PCR quantitative en temps réel)

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Etude d'événements moléculaires produits par la chimère Bcr-Abl au niveau du cytosquelette d'actine (Rôle des petites protéines G de la famille Rho)

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Diagnostic moléculaire de l'hématochromatose génétique

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Coopération entre Bcr-Abl et p95vav pour l'induction de la mobilité cellulaire médiée par les GTPases de la famille Rho

La protéine chimère Bcr-Abl résulte de la translocation chromosomique réciproque t(9 ;22). Cette protéine existe sous deux formes principales : p190bcr-abl, responsable de la Leucémie Aiguë Lymphoblastique, et p210bcr-abl, responsable de la Leucémie Myéloïde Chronique. La seule différence structurale entre ces deux formes est la présence chez p210bcr-abl du domaine DH (Dbl Homology) de Bcr, porteur d'une activité d'échange pour les petites protéines G de la famille Rho. De plus, la protéine p95vav, présentant également un domaine DH, est complexée sous forme activée aux deux formes de Bcr-Abl. Bcr-Abl intervient dans de nombreuses voies de signalisation comme l'inhibition de l'apoptose, la prolifération ou la réorganisation du cytosquelette d'actine. Le travail présenté dans ce mémoire a permis de démontrer que dans l'activation des GTPases de la famille Rho induite par Bcr-Abl, Vav est responsable de l'activation de Rac1 et Bcr-Abl de RhoA. L'activation de Cdc42, induite en partie par Vav, passe certainement par une autre protéine à activité facteur d'échange qui reste à identifier. De plus, nos résultats suggèrent l'existence d'une synergie entre les domaines DH des protéines GEF, facilitant l'activation des GTPases. Enfin, nous avons pu démontrer que l'activité facteur d'échange de Vav n'est pas indispensable au pouvoir transformant de Bcr-Abl et qu'un autre domaine de Vav y participe. Au niveau de la mobilité cellulaire induite par Bcr-Abl, nous avons montré que les mouvements amoeboïdes sont liés à l'activation de RhoA, ce qui contredit certaines données de la littérature. Enfin, nous avons mis en évidence une nouvelle voie d'activation de Rac1 impliquant la protéine Vav2 et la GTPase RhoG. Ces éléments nous ont permis de faire évoluer le modèle d'activation différentielle des petites protéines G de la famille Rho dans le cadre des leucémies et nous avons proposé ce modèle, centré sur l'activation différentielle de RhoA, pour le suivi moléculaire des patients.The chimerical oncogene BCR-ABL is known to induce autonomous motility of leukemic cells. We previously showed that p210bcr-abl responsible for chronic myelogenous leukaemia activates RhoA and Rac1, while p190bcr-abl, associated with acute lymphoid leukaemia, although devoid of a DH domain activates Rac1, but not RhoA. Moreover p95vav is present in an activated state in complex with Bcr-Abl. Here, we investigated the regulation of GEF activities in the BCR-ABL complex. For that purpose, different GEF activity mutants of Vav and of BCR-ABL were constructed and stably transfected in Ba/F3 cells. We demonstrated that RhoA is exclusively activated by the DH domain of p210bcr-abl, while Rac1 activation was only due to Vav. We show that p210bcr-abl induces a specific amoeboid mobility which is due to RhoA activity, while p190bcr-abl induces a rolling type mobility associated with Rac1 activity. Finally, our results reveal a synergistic mechanism between BCR-ABL and Vav GEFs. Moreover, we demonstrated the presence of Vav2 and GTPase RhoG in the complex with Bcr-Abl. This new signaling pathway cooperates with Vav to activate Rac1 and probably Cdc42. Recently, using blood patient samples, we proved that our model of differential activation of Rho GTPases in leukemia disease is valid. We proposed a molecular study to follow up the leukemia diseases of patients.POITIERS-BU Sciences (861942102) / SudocSudocFranceF

Interaction et activation différentielles des petites protéines G de la famille rho par p210bcr-abl et p190bcr-abl

Le chromosome Philadelphie associé à certaines leucémies résulte d'une translocation chromosomique réciproque t (9 ; 22) mettant en phase les gènes Bcr et Abl. Selon le point de cassure dans le gène Bcr, différentes protéines chimériques sont produites, p210bcr-abl responsable de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) et p190bcr-abl responsable de la Leucémie Aigüe Lymphoblastique (LAL). La seule différence entre les deux formes de Bcr-Abl est l'absence du domaine DH de Bcr dans la forme p190. Il s'agit d'un domaine d'homologie avec le domaine Dbl, un facteur d'échange pour les GTPases de la famille Rho. Nous avons pu montrer que la chimère p210bcr-abl est capable de lier et d'activer les trois GTPases RhoA, Rac1 et Cdc42. La chimère p190bcr-abl, malgré l'absence du domaine GEF, est capable d'activer Rac1 et Cdc42. Cette activité facteur d'échange observée pour p190bcr-abl semble provenir de partenaires associés à la fois à p210bcr-abl et à p190bcr-abl comme la protéine Vav possédant une activité facteur d'échange pour Rac1 et Cdc42. En revanche, p210bcr-abl est capable par son domaine GEF d'activer directement la petite protéine G RhoA. Ces résultats nous ont permis de mettre en place un modèle hypothétique de régulation de l'activité de ces GTPases par Bcr-Abl au sein des deux pathologies.The Philadelphia chromosome associated with several leukaemia results a reciprocal translocation between the Abl gene on chromosome 9 and the Bcr gene on chromosome 22. Depending on locations of the breakpoint on the BCR genome, there are two alternative forms of BCR-ABL: p210bcr-abl, found in chronic myelogenous leukemia (CML), and p190bcr-abl, found in acute lymphocytic leukemia (ALL). The only difference between both forms of Bcr-Abl is the absence of the DH domain of Bcr in the form p190bcr-abl. The present work showed interactions and activation of Rho family GTPases by Bcr-Abl thanks to techniques of coimmunoprecipitation, pull-down, GEF activity and confocal microscopy. We can demonstrate that p210bcr-abl interacts and activates RhoA, Rac1 and Cdc42. In spite of the lack of a GEF domain, the p190bcr-abl is able to activate Rac1 and Cdc42. This GEF activity from p190bcr-abl seems to come from partners associated like Vav protein having an GEF activity from Rac1 and Cdc42. We showed the Vav protein presence in complex in the form activated with Bcr-Abl. In contrast, p210bcr-abl is able to activate directly RhoA by the GEF domain of Bcr. These results allowed to set up a model of development of leukaemia Philadelphia chromosome, in which Rac1 and Cdc42 activated by p190bcr-abl and p210bcr-abl are implicated in the cellular transformation (in inhibition of apoptosis, cell motility and proliferation). Whereas the specific activation of RhoA by p210bcr-abl regulated the myeloid cell differentiation, that is the characteristic during the chronic phase of the CML.POITIERS-BU Sciences (861942102) / SudocSudocFranceF

Rôle des GTPases de la famille Rho dans la résistance à l'apoptose induite par Bcr-Abl

Certaines leucémies sont associées au chromosome Philadelphie. Il résulte d'une translocation chromosomique qui entraîne la production d'une protéine chimérique Bcr-Abl de 210 kD ou 190 kD. La seule différence entre les deux formes de Bcr-Abl est l'absence du domaine DH de Bcr (domaine d'homologie avec le domaine Dbl, un facteur d'échange pour les GTPases de la famille Rho) dans la forme p190. Alors que la protéine Abl est une tyrosine kinase finement régulée, l'activité tyrosine kinase d'Abl devient constitutive dans Bcr-Abl et cette protéine est délocalisée. Par ailleurs, Bcr-Abl active la prolifération et inhibe l'apoptose des cellules qui l'expriment. Des interactions entre les GTPases de la famille Rho et Bcr-Abl ont été récemment mises en évidence au laboratoire. Notre objectif était d'étudier le rôle potentiel des GTPases de la famille Rho dans la résistance à l'apoptose induite par Bcr-Abl. Nous avons tout d'abord montré le rôle de RhoA dans plusieurs voies de signalisation dans des cellules adhérentes. Nous avons ensuite comparé la sensibilité d'une lignée murine de type lymphocytaire exprimant ou non Bcr-Abl à l'apoptose et étudié la régulation des voies apoptotiques. En particulier, nous avons montré que le LY294002, inhibiteur de la PI-3 K n'avait pas d'action sur les cellules exprimant Bcr-Abl. En revanche, le STI-571, un inhibiteur sélectif de l'activité tyrosine kinase d'Abl agit spécifiquement sur ces cellules. Enfin, l'association de ces deux agents induit une potentialisation de l'effet du STI-571 sur les cellules exprimant Bcr-Abl. Enfin, nous avons établi et caractérisé des lignées cellulaires exprimant simultanément Bcr-Abl et l'une des formes des GTPases de la famille Rho et nous avons étudié les modifications induites par ces GTPases sur l'apoptose. Nous avons ainsi montré que le blocage de Rac1 ou de Cdc42 sous forme dominante positive ou négative induisait une inhibition variable de l'apoptose des cellules exprimant Bcr-Abl.Several leukaemia result from a chromosomal translocation, which produces a chimeric Bcr-Abl protein of either 210 kD or 190 kD. The only difference between both forms of Bcr-Abl is the absence of the DH domain of Bcr in p190. Bcr-Abl has a constitutive tyrosine kinase activity and is delocalised. It activates proliferation and inhibits apoptosis. The aim of this work was to study the role of Rho family GTPases in the resistance to apoptosis induced by Bcr-Abl. We showed the role of RhoA in several signalling pathways in adherent cells. Then we compared the sensitivity to apoptosis of murine B prolymphocytes, expressing or not Bcr-Abl, and studied regulation of apoptotic pathways. At last, we established and characterised cell lines co-expressing Bcr-Abl and Rho family GTPases and we studied modifications induced by theses GTPases on apoptosis.POITIERS-BU Sciences (861942102) / SudocSudocFranceF

The moderating role of the COMT genetic polymorphism on the exercise - cognition relationship in the elderly

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