Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution

SummaryAlthough membrane shape varies greatly throughout the cell, the contribution of membrane curvature to transmembrane protein targeting is unknown because of the numerous sorting mechanisms that take place concurrently in cells. To isolate the effect of membrane shape, we used cell-sized giant unilamellar vesicles (GUVs) containing either the potassium channel KvAP or the water channel AQP0 to form membrane nanotubes with controlled radii. Whereas the AQP0 concentrations in flat and curved membranes were indistinguishable, KvAP was enriched in the tubes, with greater enrichment in more highly curved membranes. Fluorescence recovery after photobleaching measurements showed that both proteins could freely diffuse through the neck between the tube and GUV, and the effect of each protein on membrane shape and stiffness was characterized using a thermodynamic sorting model. This study establishes the importance of membrane shape for targeting transmembrane proteins and provides a method for determining the effective shape and flexibility of membrane proteins

NOSA, an Analytical Toolbox for Multicellular Optical Electrophysiology

Understanding how neural networks generate activity patterns and communicate with each other requires monitoring the electrical activity from many neurons simultaneously. Perfectly suited tools for addressing this challenge are genetically encoded voltage indicators (GEVIs) because they can be targeted to specific cell types and optically report the electrical activity of individual, or populations of neurons. However, analyzing and interpreting the data from voltage imaging experiments is challenging because high recording speeds and properties of current GEVIs yield only low signal-to-noise ratios, making it necessary to apply specific analytical tools. Here, we present NOSA (Neuro-Optical Signal Analysis), a novel open source software designed for analyzing voltage imaging data and identifying temporal interactions between electrical activity patterns of different origin. In this work, we explain the challenges that arise during voltage imaging experiments and provide hands-on analytical solutions. We demonstrate how NOSA’s baseline fitting, filtering algorithms and movement correction can compensate for shifts in baseline fluorescence and extract electrical patterns from low signal-to-noise recordings. NOSA allows to efficiently identify oscillatory frequencies in electrical patterns, quantify neuronal response parameters and moreover provides an option for analyzing simultaneously recorded optical and electrical data derived from patch-clamp or other electrode-based recordings. To identify temporal relations between electrical activity patterns we implemented different options to perform cross correlation analysis, demonstrating their utility during voltage imaging in Drosophila and mice. All features combined, NOSA will facilitate the first steps into using GEVIs and help to realize their full potential for revealing cell-type specific connectivity and functional interactions

Study of a voltage-gated ion channel reconstituted in Giant Unilamellar Vesicles

Studying the role of the membrane in cell excitability is challenging using cells because of the homeostatic feedbacks preventing the external control of the relevant parameters. To circumvent these difficulties, I developed a model system in which a voltage-gated channel was reconstituted in a membrane where the composition, tension and geometry can be controlled. I thus expressed, purified and fluorescently labeled KvAP, a voltage-gated potassium channel. I then adapted a method to reconstitute the channel in Giant Unilamellar Vesicles, which are liposomes the same size as cells. I used quantitative confocal microscopy to measure the channel density in these GUVs (it can be controlled between few to thousands proteins per square micron). Furthermore, electrophysiology measurements showed that the protein is still functional after reconstitution. With these GUVs containing reconstituted KvAP, I have studied the affinity of the protein for curved membranes. I have pulled membrane nanotubes of controlled diameter from GUVs and measured the density of the protein in the tube as compared to the vesicle using confocal microscopy. I found that the channel is enriched in the nanotube and that this enrichment increases as a function of curvature, in agreement with an elasticity based theory. The second application was the study of the effect of membrane confinement on KvAP diffusion. Using single particle tracking, we found that the diffusion coefficient decreases by a factor 3 when the tube radius decreases from 250 to 10 nm. This result is in agreement with a hydrodynamic theory that extends the work of Saffman and Delbrück to cylindrical geometries.Il est difficile d'étudier in vivo le rôle de la membrane dans l'excitabilité des cellules car les paramètres pertinents (composition et état mécanique de la membrane, densité de canaux...) sont activement régulés par la cellule elle-même et donc difficilement ajustables expérimentalement. J'ai donc développé une méthode pour reconstituer un canal voltage-dépendant dans une membrane où ces paramètres peuvent être contrôlés. Pour cela j'ai exprimé, purifié et marqué KvAP, un canal potassique voltage-dépendant. J'ai ensuite adapté une méthode existante pour le reconstituer dans des Vésicules Unilamellaires Géantes (GUVs). J'ai mesuré la densité des canaux dans les GUVs grâce à la microscopie confocale. Des expériences d'électrophysiologie ont, de plus, montré que le canal reste fonctionnel après reconstitution. Ce système m'a permis d'étudier tout d'abord l'affinité du canal pour les membranes courbées. Pour cela, j'ai tiré des nanotubes de rayon contrôlé à partir de ces GUVs et j'ai mesuré la distribution du canal entre la vésicule et le tube par microscopie confocale. J'ai montré que le canal est enrichi dans le tube proportionnellement à sa courbure. Ce résultat est en accord avec une théorie basée sur l'élasticité de la membrane. Nous avons également étudié l'effet du confinement de la membrane sur la diffusion de KvAP. Par des expériences de suivi de particule unique, nous avons montré que le coefficient de diffusion le long du tube diminue d'un facteur 3 lorsque le rayon du tube décroît de 250 à 10 nm. Ce résultat est en accord avec le modèle hydrodynamique de Saffman et Delbrück appliqué à la géométrie cylindrique

Etude d'un canal potassique voltage-dépendant reconstitué dans des vésicules unilamellaires géantes

Il est difficile d'étudier in vivo le rôle de la membrane dans l'excitabilité des cellules car les paramètres pertinents (composition et état mécanique de la membrane, densité de canaux...) sont activement régulés par la cellule elle-même et donc difficilement ajustables expérimentalement. J ai donc développé une méthode pour reconstituer un canal voltage-dépendant dans une membrane où ces paramètres peuvent être contrôlés. Pour cela j ai exprimé, purifié et marqué KvAP, un canal potassique voltage-dépendant. J ai ensuite adapté une méthode existante pour le reconstituer dans des Vésicules Unilamellaires Géantes (GUVs). J ai mesuré la densité des canaux dans les GUVs grâce à la microscopie confocale. Des expériences d électrophysiologie ont, de plus, montré que le canal reste fonctionnel après reconstitution. Ce système m a permis d étudier tout d abord l affinité du canal pour les membranes courbées. Pour cela, j ai tiré des nanotubes de rayon contrôlé à partir de ces GUVs et j ai mesuré la distribution du canal entre la vésicule et le tube par microscopie confocale. J ai montré que le canal est enrichi dans le tube proportionnellement à sa courbure. Ce résultat est en accord avec une théorie basée sur l élasticité de la membrane. Nous avons également étudié l effet du confinement de la membrane sur la diffusion de KvAP. Par des expériences de suivi de particule unique, nous avons montré que le coefficient de diffusion le long du tube diminue d un facteur 3 lorsque le rayon du tube décroît de 250 à 10 nm. Ce résultat est en accord avec le modèle hydrodynamique de Saffman et Delbrück appliqué à la géométrie cylindriquePARIS-BIUSJ-Biologie recherche (751052107) / SudocSudocFranceF