Glycogenome expression dynamics during mouse C2C12 myoblast differentiation suggests a sequential reorganization of membrane glycoconjugates

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Several global transcriptomic and proteomic approaches have been applied in order to obtain new molecular insights on skeletal myogenesis, but none has generated any specific data on glycogenome expression, and thus on the role of glycan structures in this process, despite the involvement of glycoconjugates in various biological events including differentiation and development. In the present study, a quantitative real-time RT-PCR technology was used to profile the dynamic expression of 375 glycogenes during the differentiation of C2C12 myoblasts into myotubes.</p> <p>Results</p> <p>Of the 276 genes expressed, 95 exhibited altered mRNA expression when C2C12 cells differentiated and 37 displayed more than 4-fold up- or down-regulations. Principal Component Analysis and Hierarchical Component Analysis of the expression dynamics identified three groups of coordinately and sequentially regulated genes. The first group included 12 down-regulated genes, the second group four genes with an expression peak at 24 h of differentiation, and the last 21 up-regulated genes. These genes mainly encode cell adhesion molecules and key enzymes involved in the biosynthesis of glycosaminoglycans and glycolipids (neolactoseries, lactoseries and ganglioseries), providing a clearer indication of how the plasma membrane and extracellular matrix may be modified prior to cell fusion. In particular, an increase in the quantity of ganglioside G_M3at the cell surface of myoblasts is suggestive of its potential role during the initial steps of myogenic differentiation.</p> <p>Conclusion</p> <p>For the first time, these results provide a broad description of the expression dynamics of glycogenes during C2C12 differentiation. Among the 37 highly deregulated glycogenes, 29 had never been associated with myogenesis. Their biological functions suggest new roles for glycans in skeletal myogenesis.</p

An original SERPINA3 gene cluster: Elucidation of genomic organization and gene expression in the Bos taurus 21q24 region

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The superfamily of <b><it>ser</it></b>ine <b><it>p</it></b>roteinase <b><it>in</it></b>hibitors (serpins) is involved in numerous fundamental biological processes as inflammation, blood coagulation and apoptosis. Our interest is focused on the SERPINA3 sub-family. The major human plasma protease inhibitor, α1-antichymotrypsin, encoded by the <it>SERPINA3 </it>gene, is homologous to genes organized in clusters in several mammalian species. However, although there is a similar genic organization with a high degree of sequence conservation, the reactive-centre-loop domains, which are responsible for the protease specificity, show significant divergences.</p> <p>Results</p> <p>We provide additional information by analyzing the situation of <it>SERPINA3 </it>in the bovine genome. A cluster of eight genes and one pseudogene sharing a high degree of identity and the same structural organization was characterized. Bovine <it>SERPINA3 </it>genes were localized by radiation hybrid mapping on 21q24 and only spanned over 235 Kilobases. For all these genes, we propose a new nomenclature from <it>SERPINA3-1 </it>to <it>SERPINA3-8</it>. They share approximately 70% of identity with the human <it>SERPINA3 </it>homologue. In the cluster, we described an original sub-group of six members with an unexpected high degree of conservation for the reactive-centre-loop domain, suggesting a similar peptidase inhibitory pattern. Preliminary expression analyses of these bovSERPINA3s showed different tissue-specific patterns and diverse states of glycosylation and phosphorylation. Finally, in the context of phylogenetic analyses, we improved our knowledge on mammalian SERPINAs evolution.</p> <p>Conclusion</p> <p>Our experimental results update data of the bovine genome sequencing, substantially increase the bovSERPINA3 sub-family and enrich the phylogenetic tree of serpins. We provide new opportunities for future investigations to approach the biological functions of this unusual subset of serine proteinase inhibitors.</p

Contribution à l'étude de l'a(1,4)-fucosylation chez les végétaux (Purification partielle de l'a(1,4)-fucosyltransferase de S. alba et clonage du gène correspondant chez A. thaliana)

Parmi les oses qui entrent dans la composition des N-glycannes végétaux, le fucose peut être transféré respectivement selon une liaison a(1,3)- sur le chitobiose et/ou en a(1,4) sur un groupement de lacto-N-biose par des a(1,3) ou des a(1,4)-fucosyltransférases. Cependant, aucun gène d'a(1,4)-fucosyltransférase n'a été cloné à ce jour. Dans le but d'obtenir des données moléculaires sur les a(1,4)-fucosyltransférases végétales, une démarche de purification protéique et une approche de clonage de gènes ont été entreprises. La purification protéique a été réalisée sur des cellules en culture de Silene alba. Bien que partielle, elle a permis de caractériser l'enzyme végétale en termes de spécificités de substrats accepteurs et de mécanisme catalytique. Elle a également permis de proposer l'hypothèse de l'existence d'une forme soluble d'a(1,4)-fucosyltransférase chez cette espèce en plus d'une forme membranaire.Avec le modèle Arabidopsis thaliana, nous avons pu identifiér le premier gène végétal codant une a(1,4)-fucosyltransférase.Cette enzyme présente quelques similitudes avec les autres a(1,3/4)-fucosyltransférases connues et s'exprime dans les différents organes étudiés de la plante (feuilles, racines et fleurs). l'étude de la répartition tissulaire et cellulaire du produit de l'a(1,4)-fucosyltransférase, le motif Lewis a, confirme les résultats obtenus et montre en plus que les protéines a(1,4)-fucosylées sont essentiellement présentes à la surface de la cellule végétale et dans les différents organes étudiés,végétatifs comme reproducteurs.LIMOGES-BU Sciences (870852109) / SudocSudocFranceF

Les O-fucosyltransférases (caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle de Pofut1 murine dans la différenciation de la cellule musculaire)

La O-fucosylation est l ajout d un fucose sur un résidu sérine ou thréonine compris dans deux types de domaines peptidiques, les EGF et les TSR. Cette modification post-traductionnelle dépend de deux enzymes, Pofut1 pour les EGF et Pofut2 pour les TSR. Nous avons étudié l évolution des gènes Pofut1 et Pofut2, et avons démontré que ces gènes présents en un seul exemplaire, existaient déjà chez l'ancêtre des Bilatériens voire des Métazoaires, probablement sous forme morcelée. Une situation originale existe pour Pofut2, retrouvé chez un groupe de Protozoaires, les Apicomplexés. La structure des deux gènes chez le bovin et leur expression tissulaire ont été établies. Nous trouvons une situation inédite puisqu'il existe pour chacun d entre eux, cinq variants transcriptionnels dont un seul code l'enzyme active, différemment exprimés selon les tissus bovins. Les enzymes Pofut1 et Pofut2 actives seraient présentes dans tous les tissus analysés, à l exception notable des muscles squelettiques de l'adulte où des formes atypiques sont présentes. Les autres variants transcriptionnels, la plupart tronqués, auraient un rôle dans la régulation du taux d'expression des gènes. Pofut1 est la première fucosyltransférase à avoir été identifiée comme résidente du réticulum endoplasmique. D'un point de vue fonctionnel, nous avons démontré chez le bovin que cette glycosyltransférase, porteuse de deux N-glycanes vraisemblablement de type oligomannosidique, était correctement repliée et donc douée d'une activité enzymatique, à condition que son premier site de N-glycosylation soit occupé. L activité des récepteurs Notch et de leurs ligands présents à la surface de nombreuses cellules est modulée par l état de O-fucosylation de leurs domaines EGF. Etant donné l implication de ces récepteurs dans la régulation de la myogenèse, la O-fucosylation doit y contribuer tout autant. Ainsi, nous avons débuté une étude des répercussions d une modulation de l expression de Pofut1 sur la différenciation de cellules primaires myoblastiques bovines et de cellules murines de la lignée C2C12. Nous montrons que la surexpression transitoire de l enzyme Pofut1 murine retarde l expression des facteurs de transcription myogéniques de la famille bHLH: Myf5, MyoD, Myogénine et MRF4. Ces résultats, encore préliminaires, ouvrent de nouvelles et passionnantes perspectives d analyse de l influence des O-fucosyltransférases au cours du processus de myogenèse.O-fucosylation is the addition of a fucose on serine or threonine comprised in two types of peptidic domains, EGF and TSR. This post-translational modification depends on two enzymes. Pofut1 is responsible for O-fucosylation of EGF repeats, whereas Pofut2 adds fucose on TSR. We studied the evolution of Pofut1 and Pofut2 genes and demonstrated that these genes, present in a single copy, already existed in the ancestor of Bilaterians, or even Metazoans, probably in polyexonic form. An original situation exists for Pofut2, recovered in a group of Protozoans, the Apicomplexa. Structures of the two bovine genes and their tissular expression have been established. We find an original situation since it exists for each of them, five transcript variants of which only one encodes the active enzyme, differently expressed among bovine tissues. The Pofut1 and Pofut2 active enzymes would be present in all analyzed tissues, except for adult skeletal muscles where atypical forms are present. The other transcript variants, more or less truncated, probably play a role in regulating the expression level of these genes. Pofut1 is the first fucosyltransferase to have been identified as an endoplasmic reticulum resident. Functionally, we demonstrated for the bovine that this glycosyltransferase, bearing two N-glycans probably of oligomannosidic type, was correctly folded and therefore possessed an enzymatic activity, provided its first site of N-glycosylation is occupied. The activity of the Notch receptors and their ligands, present at the surface of numerous cells, is modulated by the state of O-fucosylation of their EGF domains. Considering the implication of these receptors in the regulation of myogenesis, Ofucosylation must contribute all as much there. Thus, we started a study of the repercussions of a modulation of Pofut1 expression on the differentiation of bovine primary muscular cells and murine cells of the C2C12 lineage. We show that the transient surexpression of the murine Pofut1 enzyme delays the expression of myogenic transcription factors belonging to bHLH family: Myf5, MyoD, Myogenine and MRF4. These preliminary results open new and exciting perspectives of analysing the influence of O-fucosyltransferases during the complex process of myogenesis.LIMOGES-BU Sciences (870852109) / SudocSudocFranceF

La protéine-O-fucosyltransférase 1 (Pofut1) (caractérisation fonctionnelle et régulation de la voie de signalisation de Notch au cours de la myogenèse)

La myogenèse du muscle squelettique est un processus complexe dont certaines étapes sont régulées par la voie de signalisation de Notch. Chez les Mammifères, la présence de O fucosylglycannes sur la partie extracellulaire des récepteurs Notch influence l activation de la voie de signalisation. Leur synthèse débute par l action de la O fucosyltransférase Pofut1. Au cours de ce travail de thèse, nous avons mis en évidence, par mutagenèse dirigée, l implication du site conservé de N glycosylation N65 pour l intégrité structurale de Pofut1. Ceci constitue un nouvel exemple de l influence de la N glycosylation dans le repliement des glycoprotéines. Des analyses combinant l utilisation de la lignée de cellules myoblastiques C2C12 et le suivi de l expression des gènes de la myogenèse, constructeurs des O-fucosylglycannes et des acteurs de la voie de Notch, par PCR quantitative en temps réel et à haut débit, nous ont permis de proposer un modèle décrivant le fonctionnement de la voie de signalisation de Notch durant la différenciation myogénique. Ce modèle met en évidence le rôle majeur de plusieurs acteurs de cette voie de signalisation comme Dll1, Notch3, Lfng et Pofut1. Il constitue un point de départ nécessaire aux analyses de la sur- et sous-expression de Pofut1 lors de la différenciation myogénique. Dans cette perspective, nous avons construit une souche de cellules C2C12 surexprimant Pofut1. A terme, les études sur les modifications de l expression des gènes impliqués dans la biosynthèse des O-fucosylglycannes nous permettront de connaître plus précisément, les mécanismes moléculaires qui orchestrent la voie de signalisation de Notch dans le processus de myogenèse.Skeletal myogenesis is a complex process in which some steps are regulated by Notch signaling pathway. In mammals, the presence of O-fucosylglycans on the extracellular domain of Notch receptors influences the activation of signalling pathway. Pofut1 is an O-fucosyltransferase that initiates O fucosylglycans synthesis. During this thesis work, we have identified, by site-directed mutagenesis, the involvement of the conserved N-glycosylation site at position 65, N65, in Pofut1 structural integrity. This is an additional example of the influence of N-glycosylation in glycoprotein folding. Analysis using myogenic C2C12 cell line, and real-time quantitative PCR allowed us to study expression of genes involved in myogenesis, Notch signaling and O-fucosylglycans synthesis. We consequently suggest a model which defines the mechanism of Notch signaling during myogenic differentiation. This model highlights the essential role of several actors of this signalling pathway including Dll1, Notch3, Lfng and Pofut1. It constitutes a necessary starting point for further studies concerning Pofut1 over- and down-expression, during myogenic differentiation. Therefore, we created a C2C12 cell line over-expressing Pofut1. Ultimately, studies on expression modifications of genes implicated in O fucosylglycan biosynthesis will enable us to more precisely understand molecular mechanisms that orchestrate Notch signalling in the process of myogenesis.LIMOGES-BU Sciences (870852109) / SudocSudocFranceF

Alteration of gibberellin response in transgenic tobacco plants which express a human Lewis fucosyltransferase.

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Régulation de l'activité a(1,4)fucosyltransférase au cours du développement végétatif et floral du tabac (Nicotiana tabacum cv Xanthi)

Les motifs Lewis(a), générés par les a4-fucosyltransférases, interviennent principalement en tant que signaux de reconnaissance et de communication entre cellules.Néanmoins, les fonctions de l'a4-fucosylation des protéines dans les cellules végétales restent à définir. Nous nous sommes engagés dans l'étude de l'expression de l'activité a(1,4)fucosyltransférase et de la distribution des glycotopes Lewis(a) durant le développement du tabac. Au cours du développement végétatif, l'a4-fucosyltransférase est une enzyme non seulement exprimée de façon ubiquiste mais aussi d'un point de vue spatio-temporel. Nous montrons également que cette activité enzymatique est régulée au cours d'évènements particuliers comme l'élongation cellulaire et la lignification. L'importance de cette régulation est confirmée par l'étude de plants de tabac, exprimant l'a3/4-fucosyltransférase FUT3 humaine. Ces plants présentent un retard de croissance lié à un défaut d'élongation cellulaire. Un phénotype sauvage peut, néanmoins, être rétabli par un apport en gibbérellines. L'étude du développement floral a révélé un profil d'expression de l'activité a(1,4)fucosyltransférase spécifique du grain du pollen. L'a4-fucosyltransférase endogène est régulée comme une protéine "tardive" lors de la microgamétogénèse. De plus, les N-glycoprotéines a4-fucolisées semblent essentielles lors de la germination du grain de pollen et la croissance du tube pollinique. Une dé-régulation de l'activité a(1,4)fucosyltransférase, par surexpression de la FUT3 humaine, induit des altérations structurales et fonctionnelles des grains de pollen. En conclusion, nous montrons que les glycotopes Lewis(a) constituent des facteurs modulant la conformation et/ou de la fonction des glycoprotéines. Ces protéines joueraient, par ailleurs, des rôles clés dans les mécanismes aussi variés que fondamentaux que sont l'élongation cellulaire, la lignification et le développement du grain de pollenLIMOGES-BU Sciences (870852109) / SudocSudocFranceF