Identification of a structural element of the hepatitis C virus minus strand RNA involved in the initiation of RNA synthesis

The replication of the genomic RNA of the hepatitis C virus (HCV) of positive polarity involves the synthesis of a replication intermediate of negative polarity by the viral RNA-dependent RNA polymerase (NS5B). In vitro and likely in vivo, the NS5B initiates RNA synthesis without primers. This de novo mechanism needs specific interactions between the polymerase and viral RNA elements. Cis-acting elements involved in the initiation of (–) RNA synthesis have been identified in the 3′ non-coding region and in the NS5B coding region of the HCV RNA. However, the detailed contribution of sequences and/or structures of (–) RNA involved in the initiation of (+) RNA synthesis has been less studied. In this report, we identified an RNA element localized between nucleotides 177 and 222 from the 3′-end of the (–) RNA that is necessary for efficient initiation of RNA synthesis by the recombinant NS5B. By site-directed mutagenesis experiments, we demonstrate that the structure rather than the primary sequence of this domain is important for RNA synthesis. We also demonstrate that the intact structure of this RNA element is also needed for efficient RNA synthesis when the viral NS5B functions in association with other viral and cellular proteins in cultured hepatic cells

Sélection et caractérisation d'aptamères inhibiteurs de l'ARN polymérase ARN dépendante du virus de l'hépatite C

BORDEAUX2-BU Santé (330632101) / SudocSudocFranceF

L'ARN polymérase ARN dépendante du virus de l'Hépatite C (VHC) (expression et étude de son mécanisme d'action in vitro)

Le virus de l'hépatite C(VHC) est l'agent étiologique de la plupart des cas d'hépatites non-A non-B post-transfusionnelles ou sporadiques. Les traitements actuels proposés étant inefficace dans 50 % des cas, le développement de traitements anti-VHC nouveaux et spécifiques est donc nécessaire. Parmi les fonctions virales essentielles à la réplication virale, une des cibles les plus attractives pour le développement d'anti-viraux est l'étape de synthèse de l'ARN génomique assurée par l'ARN polymérase dépendante (NS5B) codée par le génome du VHC. Afin d'étudier l'initiation de la synthèse d'ARN à partir du génome du VHC, nous avons utilisé des ARN transcrits in vitro correspondant à l'extrémité 3' de l'ARN (-) et (+) comme matrices pour la synthèse d'ARN catalysée par la NS5B purifiée du VHC. Les résultats de ces expériences montrent que la capacité de synthèse de l'enzyme n'est pas la même suivant la matrice ARN utilisée, et que les 341 premiers nucléotides correspondant à l'extrémité 3' de l'ARN (-) sont les plus efficacement copiés par l(enzyme. L'importance et la forte conservation de cette région ARN nous a encouragé à développer une stratégie antisens afin d'obtenir des séquences oligonucléotidiques qui pourraient bloquer ou ralentir la réplication de l'ARN viral. Parmi les ODN complémentaires de l'extrémité 3' de l'ARN (-) testés, 4 inhibent la synthèse d'ARN avec un IC50 inférieure à 1 uM. Cette inhibition est séquence spécifique et l'introduction d'une modification 2'-O-méthyl ou phosphoramidate abaisse l'IC50 nM et 30 nM respectivement) d'environ 12 fois pour l'un des 4 ODN inhibiteurs, l'ODN7. Nos résultats suggèrent que l'ODN7 inhibent la synthèse d'ARN en interférant avec des motifs structuraux important pour une initiation efficace de la synthèse d'ARN, présents à l'extrémité 3' de l'ARN(-).BORDEAUX2-BU Santé (330632101) / SudocSudocFranceF

Inhibition of Hepatitis C Virus (HCV) RNA Polymerase by DNA Aptamers: Mechanism of Inhibition of In Vitro RNA Synthesis and Effect on HCV-Infected Cells▿ †

We describe here the further characterization of two DNA aptamers that specifically bind to hepatitis C virus (HCV) RNA polymerase (NS5B) and inhibit its polymerase activity in vitro. Although they were obtained from the same selection procedure and contain an 11-nucleotide consensus sequence, our results indicate that aptamers 27v and 127v use different mechanisms to inhibit HCV polymerase. While aptamer 27v was able to compete with the RNA template for binding to the enzyme and blocked both the initiation and the elongation of RNA synthesis, aptamer 127v competed poorly and exclusively inhibited initiation and postinitiation events. These results illustrate the power of the selective evolution of ligands by exponential enrichment in vitro selection procedure approach to select specific short DNA aptamers able to inhibit HCV NS5B by different mechanisms. We also determined that, in addition to an in vitro inhibitory effect on RNA synthesis, aptamer 27v was able to interfere with the multiplication of HCV JFH1 in Huh7 cells. The efficient cellular entry of these short DNAs and the inhibitory effect observed on human cells infected with HCV indicate that aptamers are useful tools for the study of HCV RNA synthesis, and their use should become a very attractive and alternative approach to therapy for HCV infection