ЗАСЕЛЕНИЕ ДЕМИНЕРАЛИЗОВАННОГО КОСТНОГО МАТРИКСА КЛЕТКАМИ ХОНДРОГЕННОГО РЯДА

Aim To determine optimal approaches of demineralized bone tissue processing after preservation to ensure efficient seeding of chondrocytes. Methods Demineralized bone matrix specimens sized 1 x 1 x 1 cm3 were used in the experiment. A purification method ensuring the removal of cytotoxic substances from the matrices has been developed. It consists of a multi-stage soaking of the specimens in H2O, 0.1H NaOH, 1N NaOH, H2O and DPBS until a neutral pH is reached. After chemical purification (a 3-stage process), all the specimens were subjected to sonication for 1 minute at 5W to improve cell adhesion. The water was changed after each exposure. Then, the water was replaced to DPBS and the specimens were sonicated for 1 minute at 5W. After it, the sample was placed in a neutral medium (pH 7.0). The matrices undergoing sonicated procession were seeded with cells. Hyaline cartilage of minipigs was used as a source of the cells. Chondrocytes were isolated using collagenase II digestion and cultured for 20 days in the culture flasks. Passage 1 chondrocytes were seeded on the matrices. DBM were pretreated with a 1% gelatin solution to improve the efficiency of cell seeding. The microtitration viability test estimating the impact of the extract obtained during sonation cycles on cell viability was performed to determine whether these matrices may be seeded with chondrocytes. The test was performed on the lag- and log-phase cells. The effect of the extract on the cells lasted around 3 days. Results Extract-treated chondrocytes during the lag-phase showed a direct dose-dependent cytotoxic effect, compared to extract-treated chondrocytes during the log-phase. Low efficiency of DBM was associated with both, the stringent requirements for the manufacturing process of DBM and the subsequent matrices processing, including the cell growth phases. The increased cell migration depth into the matrices resulted in the disturbances of the microcirculation, leading to the insufficient cell feeding and slowed down metabolic processes. Conclusion The efficiency of DBM cell seeding depends on the matrix processing, its cytotoxic effect and architectonics. The problem of slowing down the metabolism of cells in DMB may be solved by the application of the combined purification technique, i.e. chemical and ultrasonic purification methods. The obtained results prove the necessity of using mechanical and electrical stimuli for the normal functioning of bone and cartilage tissue cells within the matrix.Цель Поиск эффективных способов обработки деминерализованной костной ткани после консервации для эффективного заселения хондроцитами. Материалы и методы В качестве материала исследования использовали деминерализованный костный матрикс размером 1 х 1 х 1 см³. Для удаления цитотоксических веществ из матриц разработан способ очистки, заключающийся в поэтапном замачивании образца в Н2О, растворе 0,1 Н NaOH, растворе 1 н NaOH, Н2О и DPBS до нейтрального pH. Для улучшения клеточной адгезии на матрицах, на последние перед заселением воздействовали ультразвуком. На образец, прошедший химическую очистку 3 раза, воздействовали ультразвуком в течение 1 минуты и W = 5. После каждого воздействия, воду в емкости меняли. После этого воду в емкости сменили на DPBS и обрабатывали ультразвуком в течение 1 минуты и W = 5. После окончания процедур образец находился в нейтральной среде (pH 7,0). Обработанные таким способом матрицы заселяли клетками. В качестве источника клеток для заселения, была выбрана ткань гиалинового хряща мини-поросенка. Хондроциты выделяли стандартным способом с применением коллагеназы II типа и культивировали в течение 20 суток в культуральных флаконах. Матрицы заселяли хондроцитами 1 пассажа. Для повышения эффективности заселения костного матрикса клетками был апробирован способ предварительной обработки деминерализованной костной ткани 1% раствором желатина. Для определения пригодности матрикса к заселению его хондроцитами использовали микротитрационный тест влияния экстракта, получаемого в ходе ультразвуковой обработки матрицы, на жизнеспособность клеток. Тест проводили на лаг- и лог-фазах роста клеток. Воздействие экстракта на клетки длилось 3 суток. Результаты Показано, что обработка хондроцитов экстрактом на этапе лаг-фазы роста культуры оказывает прямой дозозависимый цитотоксический эффект, в отличие от эффекта обработки хондроцитов в фазе логарифмического роста культуры. Показано, что низкая эффективность заселения деминерализованного костного матрикса связана не только с жесткими условиями изготовления ДКМ, но и от условий последующей подготовки матрицы, фазы роста заселяемой клеточной культуры. С увеличением глубины миграции клеток вглубь матрицы нарушается микроциркуляция, что ведет к недостаточному обеспечению клеток в тканеинженерной конструкции питанием и замедлению метаболических процессов. Заключение Эффективность равномерного заселения деминерализованного костного матрикса клетками связана не только с условиями обработки матрикса, выраженным цитотоксическим эффектом, но и с его архитектоникой. Проблема замедления метаболизма клеток в тканеинженерной конструкции решается путем комбинированного метода очистки ДКМ химическим и ультразвуковым способом. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости применении механических и электрических стимулов для нормального функционирования клеток костной и хрящевой ткани внутри матрицы

ОСОБЕННОСТИ РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТНОЙ ТКАНИ ТЕЛ ПОЗВОНКОВ НА ОСНОВЕ ОСТЕОТРАНСПЛАНТАТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Aim. To assess osteogenic potentialities of a three-di-   components, enzymes and vessels with endothelial lining. mensional osteograft in a mini pig model with artificial   Structural composition of the osteograft is an analogue of vertebral body defect. The osteograft consists of osteo-               embryonic bone tissue, which was the basis for examining the regenerative potentialities of the osteograft in the ex-periment.Methods. The osteograft was implanted in the defect of the lumbar vertebral body of minipig (6 months old). The animals were withdrawn from the experiment in the period from 14 days to 6 months. In the control series, autobone was implanted in a similar defect. The preparations were examined by morphological methods, and bone tissue density was assessed by MSCT.Results. Regeneration and integration of the bone tissue of the vertebral body with the defect replaced by the osteograft was by primary angiogenic osteogene sis within one month due to the structural components of the osteograft. When the defect is replaced by autograft, the regeneration and integration of the bone tissue of the vertebral body occur within six months due to the structural components of the recipient.Conclusion. Formation of the common blood flow of the transplant and recipient vessels is both a factor of integration of the transplant into the homeostatic system of the recipient, and a pathogenic mechanism for optimizing the regeneration of bone tissue defect on the basis of the graft.Цель. На экспериментальной модели артифициального дефекта тела позвонка мини-поросенка исследованы остеогенные потенции трехмерного остеотрансплантата. Остеотрансплантат состоит из клеток остеогенного ряда, матрикса, содержащего костные белки, минеральные компоненты, ферменты и сосуды с эндотелиальной выстилкой. Структурная композиция остетрансплантата является аналогом эмбриональной костной ткани, что явилось основанием для исследования регенераторных потенций остеотрансплантата в эксперименте.Материалы и методы. В дефект тела поясничного позвонка мини-поросенка (6 месяцев) имплантировали остеотрансплантат. Животных выводили из эксперимента в сроки от 14 дней до 6 месяцев. В контрольной серии в подобный дефект имплантировали аутокость. Препараты исследова ескими методами, плотность костной ткани оценивали методом МСКТ.Результаты. Регенерация и интеграция костной ткани тела позвонка при замещении остеотрансплантатом происходит первичным ангиогенным остеогенезом за счет структурных компонентов остеотрансплантата в течение одного месяца. Регенерация и интеграция  сплантатом происходит за счет структурных компонентов реципиента в течение шести месяцев.Выводы. Формирование общего кровотока трансплантата и сосудов реципиента является фактором интеграции трансплантантата в гомеостатическую систему реципиента и патогенетическим механизмом оптимизации регенерации дефекта костной ткани на основе трансплантата

ИТТЕРБИЕВЫЕ КОМПЛЕКСЫ ПОРФИРИНОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В МЕДИЦИНЕ

Malignant tumors are the second most frequent cause of death after cardiovascular diseases. The photodynamic therapy based on the interaction of laser light with different photosensitizers was discovered in the 20th century as one of treatment methods. When using photosensitizers, the process of singlet oxygen and other active forms generation is observed in both malignant and healthy body tissues, which leads to a number of adverse reactions. More promising diagnostic compounds that do not have these disadvantages are ytterbium porphyrin complexes. These compounds slightly generate singlet oxygen under light irradiation, while maintaining a high level of tumorotropic agents as for therapeutic photosensitizers. This work continues a series of studies devoted to the analysis of physicochemical properties of Yb-complex 2,4-dimetoxyhematoporphyrin IX as a promising marker for fluorescent diagnostics of various tumors. Pharmaceutical compositions based on Yb3+-dimetoxyhematoporphyrin IX dipotassium salt were created. These compositions are capable of accumulating in the sites of inflammation and proliferation in diseases of mucosal membranes and cancer lesions. Toxicological and pharmacokinetic studies were carried out with the use of laboratory animals and volunteers. The analysis results showed that the pharmaceutical compositions are perspective for use in clinical practice.Рассмотрены области применения солей иттербия и иттербиевых комплексов с порфиринами в качестве лечебных и диагностических средств. Приведен синтез 2,4-диметоксигематопорфирина IX, исходя из гемина крови. Получена дикалиевая соль Yb-комплекса этого порфирина, исследованная в качестве перспективного нефототоксичного маркера для люминесцентной диагностики новообразований. Изучены основные фотофизические характеристики данного Yb-комплекса (электронные спектры поглощения, время жизни и интенсивность люминесценции, относительный квантовый выход 4f-люминесценции). Показано влияние колебаний OH-осцилляторов на тушение люминесценции иона Yb3+ в его комплексах с порфиринами, при этом максимальная интенсивность люминесценции наблюдается в растворе 100%-го ДМСО. С целью применения Yb-комплексов для дифференциальной диагностики патологических изменений кожи и слизистых оболочек создана фармацевтическая композиция на основе различных гелей. На основании этого впоследствии выявлено, что при люминесценции в ближнем ИК-диапазоне (900-1100 нм) достигаются высокие значения диагностического контрастного индекса измененная/здоровая ткань (3÷15). Время накопления фармацевтических композиций в различных новообразованиях составляет менее 1 часа. Предложенные фармацевтические композиции позволяют обнаруживать поврежденные участки тканей, не выявляемые визуально, и проводить контроль за лечением воспалительных заболеваний кожи и слизистых оболочек

YTTERBIUM PORPHYRINS COMPLEXES AND THEIR APPLICATION IN MEDICINE

Malignant tumors are the second most frequent cause of death after cardiovascular diseases. The photodynamic therapy based on the interaction of laser light with different photosensitizers was discovered in the 20th century as one of treatment methods. When using photosensitizers, the process of singlet oxygen and other active forms generation is observed in both malignant and healthy body tissues, which leads to a number of adverse reactions. More promising diagnostic compounds that do not have these disadvantages are ytterbium porphyrin complexes. These compounds slightly generate singlet oxygen under light irradiation, while maintaining a high level of tumorotropic agents as for therapeutic photosensitizers. This work continues a series of studies devoted to the analysis of physicochemical properties of Yb-complex 2,4-dimetoxyhematoporphyrin IX as a promising marker for fluorescent diagnostics of various tumors. Pharmaceutical compositions based on Yb3+-dimetoxyhematoporphyrin IX dipotassium salt were created. These compositions are capable of accumulating in the sites of inflammation and proliferation in diseases of mucosal membranes and cancer lesions. Toxicological and pharmacokinetic studies were carried out with the use of laboratory animals and volunteers. The analysis results showed that the pharmaceutical compositions are perspective for use in clinical practice