Highly Sensitive Immunochromatographic Identification of Tetracycline Antibiotics in Milk

A rapid immunochromatographic assay was developed for the control of tetracycline (TC). The assay is based on the competition between immobilized TC-protein conjugate and TC in a tested sample for binding with polyclonal anti-TC antibodies conjugated to colloidal gold during the flow of the sample along a membrane strip with immobilized reactants. Conjugation of colloidal gold and the total immunoglobulin (IgG) fraction of polyclonal antibodies was used to increase the assay sensitivity to ensure low content of specific antibodies in the conjugate. This allowed effective inhibition of free TC and conjugate binding in the strip test zone. Photometric marker registration allows control of the reduction of binding, thereby enhancing detection sensitivity. The proposed assay allows TC to be detected at concentrations up to 20 ng/mL, exceeding the limit of detection of the known analogues, in a wide working range (more than two orders) of 60 pg/mL to 10 ng/mL, ensured through the use of polyclonal antibodies. The assay time is 10 min. The efficiency of the designed assay is shown to identify TC in milk; the degree of recovery of TC ranges from 90 to 112%. The precision of the concentrations measurements was no more than 10%

ПОЛУЧЕНИЕ БЕЛКОВЫХ КОНЪЮГАТОВ И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ТЕТРАЦИКЛИНА

We report herein on the methods to introduce a desirable number of modifications into bovine serum albumin and horseradish peroxidase in a controlled manner. The low modification to protein ratio is required when the biological activity of the enzyme has to be preserved, and the high modification to protein ratio is needed when producing immunogens. By varying the linker and the site of antigen binding with the carrier protein, we were able to produce the antibodies of high specificity. Protein conjugates of tetracycline were synthesized and characterized. Immunization of mice was carried out and monoclonal antibodies for immunoassay of tetracycline were obtained and tested in ELISA, IC50=5 ug/ml. Разработаны методы контролируемой химической модификации бычьего сывороточного альбумина и пероксидазы хрена, позволяющие вводить в белок как минимальное число модификаций для сохранения биологической активности в иммуноанализе, так и максимальное – для получения иммуногенов, а также варьировать линкер и сайт связывания антигена с белком для повышения специфичности иммунного ответа. Получены и охарактеризованы белковые конъюгаты тетрациклина. Проведена иммунизация мышей, выделены моноклональные антитела к тетрациклину, которые испытаны в иммуноферментном анализе тетрациклина. Чувствительность определения составила IC50=5 мкг/мл.

КОНТРОЛИРУЕМОЕ ПЕГИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ АЗИДНЫМИ РЕАГЕНТАМИ-РАЗВЕТВИТЕЛЯМИ С ПОМОЩЬЮ КЛИК-ХИМИИ

Polyethyleneglycol (PEG) is nontoxic, nonimmunogenic, hydrophilic, chargeless and nonbiodegradable poliymer. Its usage as a part of therapeutics protein drugs is common in medicine practice. It is known that covalent attachment of PEG conduces to prolong blood circulation half-lives, improves drug solubility and stability and reduces immunogenicity. It allows optimizing pharmacodynamic and pharmacokinetic drug properties. The goal of structure optimization of therapeutic proteins conjugates with PEG is to reduce loss of biological activity. It can be reached through controlled site- specific pegylation. We introduce two-step modification of proteins with branched polyethylenglycols via click-chemistry, synthesis of branched PEG azide reagent on the base of tris(hydroxymethyl)aminomethane with three linear PEG polymers. At first, we introduce alkyne groups with NHS-ester of alkyne acid in BSA protein. Then, branched PEG azide reagent reacts with alkyne function via CuAAC. Purification of the conjugates was done via gel-chromotography. Number of modifications was calculated from MALDI mass-spectra.Полиэтиленгликоль (ПЭГ) является нетоксичным, неиммуногенным, гидрофильным, незаряженным и бионеразлагаемым полимером, и его использование в составе терапевтических белковых препаратов вошло в медицинскую практику. Известно, что ПЭГ, соединенный с терапевтическим белком, способствует более длительному нахождению препарата в организме, снижает его иммуногенность и антигенность, повышает растворимость и стабильность в биологических средах, что позволяет оптимизировать фармакокинетические свойства препарата. Одной из целей оптимизации структуры конъюгатов терапевтических белков с ПЭГом является максимальное сохранение биологической активности белка, что может быть достигнуто с помощью контролируемого пегилирования по заданным сайтам белковой молекулы. В настоящей работе представлен метод двухстадийной модификации белков разветвленными полиэтиленгликолями с использованием реакции [3+2] диполярного циклоприсоединения азидов к алкинам. Описан синтез азидного реагента-разветвителя на основе трис(гидроксиметил)аминометана, содержащего три остатка полиэтиленгликоля. Разработана методика двухстадийной модификации модельного белка бычь- его сывороточного альбумина, включающая введение на первой стадии алкиновых групп при помощи N-гидро- ксисукцинимидного эфира алкинокислоты, которые затем вступают в «клик»-реакцию с азидным пегилирующим реагентом-разветвителем. Полученные конъюгаты выделены с помощью гельпроникающей хроматографии. Число введенных модификаций определено при помощи МАЛДИ масс-спектрометрии

Иммуноферментный анализ метаболитов витамина D3

We report herein improved version of the synthesis of hapten based on cholecalciferol and its active metabolite 25-hydroxycholecalcalferol. The methodology of obtaining high-molecular immunogenic conjugates of vitamin D3 derivatives with bovine serum albumin and horseradish peroxidase conjugates for direct ELISA was optimized. Immunisation of rabbits was carried out and polyclonal antibodies to 25-hydroxycholecalceferol were obtained and tested in an enzyme-linked immunosorbent assay. To improve the accuracy of the method, the sample preparation procedure was optimized, including the release of vitamin D3 and its active metabolites from complexes with vitamin D-binding protein.Описан улучшенный вариант синтеза гаптена на основе холекальциферола и его активного метаболита 25-гидроксихолекальцеферола. Оптимизирована методика получения высокомолекулярных иммуногенных конъюгатов производных витамина D3 с бычьим сывороточным альбумином, а также конъюгатов с пероксидазой хрена для прямого ИФА. Проведена иммунизация кроликов, выделены поликлональные антитела к 25-гидроксихолекальцеферолу, которые испытаны в иммуноферментном анализе. Для повышения точности метода оптимизирован процесс пробоподготовки, включающий высвобождение витамина D3 и его активных метаболитов из комплексов с витамин D-связывающим белком