Молекулярное клонирование, гетерологическая экспрессия и получение соматотропина человека

Growth hormone (GH) is a polypeptide produced in the anterior pituitary lobe that triggers different biochemical pathways and increases cell proliferation and growth. In this work, the pNic based vector for periplasmatic secretion was developed. Recombinant human growth hormone was produced via periplasmatic secretion (42h, 30 °С) followed by several steps of purification. GH obtained does not contain His-tag. Expression level of 2,85 mg per1 literof bacterial culture was achieved.Соматотропин – гормон пептидной природы, синтезирующийся в передней доле гипофиза и усиливающий пролиферацию клеток и рост организма. В результате проведенного исследования разработана конструкция для периплазматической экспрессии рекомбинантного соматотропина человека на основе плазмиды pNic, подобраны условия для периплазматической бактериальной экспрессии (42 ч, 30 °С), способы выделения и очистки препарата целевого белка, не содержащего гистидинового кластера. Получен препарат целевого белка высокой степени очистки и соответствующего природному по молекулярной массе (MW 22301,9 Да). Общее количество полученного рекомбинантного соматотропина человека составило 2,85 мг на литр среды

МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ, ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ЭКСПРЕССИЯ И ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО СОМАТОТРОПИНА GALLUS GALLUS

Growth hormones (GH) are polypeptides that trigger different biochemical pathways. GH main function is to regulate anabolic and catabolic processes. GH also plays an important role as immunomodulator. In this paper, molecular cloning, heterological expression and purification of the recombinant G. gallus growth hormone have been conducted. Two biotechnological schemes have been developed: cytosol expression followed by inclusion bodies solubilisation and periplasmatic secretion. Expression levels of 2.43 and 15 mg per 1 liter of bacterial culture respectively were achieved. It has been shown that the best way of expression is periplasmatic secretion, which does not require complex solubilisation and refolding procedures and results in higher product yield and purity.Соматотропины относятся к группе полипептидных гормонов, запускающих различные каскады биохимиче­ских процессов. Основная функция соматотропина – влияние на анаболические и катаболические процессы орга­низма, а также иммуномодулирующая функция. В представленной работе проведено молекулярное клонирование, гетерологическая экспрессия и очистка рекомбинантного соматотропина Gallus gallus. Созданы две технологиче­ские схемы получения соматотропина: бактериальная экспрессия с последующей солюбилизацией телец включения и периплазматическая экспрессия соматотропина в бактериальных клетках. Выход целевого гормона составил 2,43 и 15 мг белка на литр культуральной среды соответственно. В работе показано, что наиболее оптимальной является стратегия периплазматической экспрессии, при которой нет необходимости в сложных процедурах солюбилизации и рефолдинга и получаемый белковый продукт характеризуется более высоким выходом и степенью очистки

САЙТ-СПЕЦИФИЧНОЕ БИОТИНИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НА МИКРОЧАСТИЦАХ, РЕКОМБИНАНТНОЙ БИОТИН ЛИГАЗОЙ

To obtain catalytically active recombinant biotin ligase (rBirA), we developed an approach for heterologous expression of BirA-MBP-fusion protein in E. coli cells, its purification and subsequent rBirA release by highly specific proteolysis using TEV protease. The recombinant protein is obtained in homogeneous state and retains specific catalytic activity. Enzyme immobilization on magnetic microparticles has allowed to develop an approach for effective enzymatic biotinylation combined with purification of target protein molecules on the affinity matrix.С целью получения каталитически активной рекомбинантной биотин лигазы (rBirA) разработан подход к получению сшитого белка MBP-BirA путем гетерологической экспрессии в клетках E. coli, с последующей его очисткой и высвобождением rBirA с помощью высокоспецифичного протеолиза TEV протеазой. Рекомбинантный белок получен в гомогенном состоянии и обладает специфической каталитической активностью. Использование иммобилизации на магнитных микрочастицах позволило разработать подход к эффективному ферментативному биотинилированию, совмещенному с очисткой целевых белковых молекул на аффинной матрице.

Гетерологическая экспрессия, выделение и физико-химические свойства рекомбинантного цитохрома CYP1B1 человека

In order to study the catalytic properties of CYP1B1 toward a number of steroid compounds, we have developed an effective system of heterologous expression of hemoprotein in E.coli and isolated the preparation of recombinant CYP1B1 «soluble» form in a highly purified state. The interaction parameters of the purified enzyme with steroid ligands have been determined.С целью изучения каталитических свойств СYP1B1 по отношению к ряду стероидных соединений нами разработана эффективная система гетерологической экспрессиии гемопротеида в E.coli и выделен в высокоочищенном состоянии «растворимый» препарат рекомбинантного CYP1B1. Установлены параметры взаимодействия данного фермермента с стероидными лигандами

Субстратная специфичность рекомбинантной стероид 21-гидроксилазы человека и влияние цитохрома b5 на ее активность

Human cytochrome CYP21 (steroid 21-hydroxylase) has been expressed in Escherichia coli DH5α and the expression level was 150 nmol from 1 liter of bacterial culture. Utilizing two steps of column chromatography has allowed to obtain highly purified protein. Steroids have been screened as potential substrates for the enzyme. CYP21 showed typical spectral change (type I of spectral responce) when binding with progesterone, 17α-hydroxyprogesterone and 11-hydroxyprogesterone. In addition, it has been shown that cytochrome b5 does not affect hydroxylase activity of CYP21 toward progesterone, 17a-hydroxyprogesterone and 11-hydroxyprogesterone.Цитохром CYP21 человека (стероид 21-гидроксилаза) был экспрессирован в клетках Escherichia coli DH5α (экспрессионный уровень составил 150 нмоль белка на 1 литр культуральной среды). Использование двух последовательных колоночных хроматографий позволило получить белок высокой степени очистки, обладающий специфической 21-гидроксилазной активностью по отношению к прогестерону, 17α-гидроксипрогестерону и 11-гидрокси-прогестерону. В данной работе проводился скрининг стероидов как потенциальных субстратов для белка. Впервые доказано, что 11-гидроксипрогестерон является эндогенным субстратом CYP21. Показано, что цитохром b5, в отличие от его эффекта на CYP17A1, не оказывает влияния на 21-гидроксилазную активность CYP21 по отношению к прогестерону, 11-гидроксипрогестерону и 17-гидроксипрогестерону, что свидетельствует о разных механизмах регуляции двух изоформ цитохрома Р450 в мембранах эндоплазматического ретикулума коры надпочечников

ФАГОВЫЙ ДИСПЛЕЙ В КОНСТРУИРОВАНИИ АНТИТЕЛ С ЗАДАННЫМИ СВОЙСТВАМИ

Antibodies are an essential tool being a part of immunodiagnostics, therapeutics and life science research instruments. In this paper we analyze the recent developments in recombinant antibodies generation by means of phage display technology. We also provide our own results dedicated to antibodies development process. Analysis of antibody-antigen complexes with resolved structures allow to create synthetic phage display library of Fab antibody fragments with the diversity of 1010 independent clones. Utilizing a negative selection approach, we succeeded in generation and characterization of specific single-domain antibodies that has substantially different binding kinetics to CYP11B2 and CYP11B1 isoenzymes – proteins with 93% sequence identity. We also generated specific binders to a few high-molecular weight human antigens – erytropoetin, growth hormone and thyroperoxidase.Уникальная особенность моноклональных антител высокоспецифично взаимодействовать с молекулярными мишенями позволила им занять ведущее положение в терапии онкологических и аутоиммунных заболеваний, стать незаменимым инструментом протеомных исследований и компонентом диагностических систем. Представлен обзор новейших литературных данных по использованию метода фагового дисплея для получения рекомбинантных антител, которые другими методами получить невозможно, а также собственные оригинальные результаты в этой области. На основании бионформационного анализа структур депонированных комплексов антител с антигенами нами создана комбинаторная библиотеки Fab фрагментов антител человека, обладающая разнообразием более 1010 независимых клонов и способная служить источником рекомбинантных антител. С использованием негативной селекции нами получены и характеризованы высокоспецифичные однодоменные антитела к альдостерон-синтазе (цитохром Р45011В2, CYP11B2), не обладающие в ИФА кросс-реактивностью с ее гомологом CYP11B1 (93% идентичности последовательностей), а также антитела к таким высокомолекулярным мишеням, как эритропоэтин, соматотропный гормон и тиреопероксидаза человека.

ПЕПТИДНЫЙ ФАГОВЫЙ ДИСПЛЕЙ В СКРИНИНГЕ ПЕПТИДОМИМЕТИКОВ ТРОМБОКСАН СИНТАЗЫ

In order to identify potential inhibitors and modulators of thromboxane synthase, its molecular cloning, heterologous expression, isolation, and purification have been carried out. The recombinant protein is isolated in the homogenous state and possesses the functional activity. Peptide with an amino acids sequence SGVYKVLYDWQHGGF is identified using the random dodecapeptides phage library. It is revealed that this peptide has a great similarity to thrombopoietin peptidomimetic. This allows one to suppose the role of this hormone in the thromboxane synthase regulation.С целью поиска ингибиторов и модуляторов активности тромбоксан синтазы проведена гетерологическая экспрессия, выделение и очистка тромбоксан синтазы человека. Рекомбинантный белок получен в гомогенном состоянии и обладает функциональной активностью. С использованием фаговой библиотеки рандомизированных додекапептидов идентифицирован пептид с аминокислотной последовательностью SGVYKVLYDWQHGGF, обладающий высоким сродством к белку. Показано высокое сходство его последовательности с последовательностью пептидомиметика тромбопоэтина, что позволяет предположить роль этого гормона в регуляции активности тромбоксан синтазы

ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АЗОЛСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ С ПОЛИМОРФНЫМИ ИЗОФОРМАМИ CYP2C9

Azole-containing compounds are often co-administrated with different classes of medications, and are widely used as pesticides in agriculture. Besides the main action, azole-containing compounds can directly affect the human cytochrome P450 system, inhibiting the human CYP catalytic activity, and thereby leading to metabolism disturbances and the elimination of other drugs, causing the toxic effect or resulting in a complete absence of the effect of the drug used. In the context of polypharmacy, it is important to take into account the influence of the genetic polymorphism of CYP2C9 both on the metabolism of individual drugs and on drug-drug interactions. In this paper, a comprehensive comparative study was conducted to assess the binding of various pesticides and antifungal drugs to the active center of CYP2C9*1, CYP2C9*2, CYP2C9*3. We have shown significant differences in the azole affinity to CYP2C9*1, CYP2C9*2, and CYP2C9*3. The obtained findings allow us to predict drug-drug interactions, as well as changes in the metabolism of drugs in the presence of specific xenobiotics.Азолсодержащие соединения часто назначаются совместно с другими классами лекарственных средств, а также широко применяются в сельском хозяйстве в качестве пестицидов. Помимо целевого противогрибкового действия, данный класс соединений может непосредственно влиять на цитохромы P450 человека, ингибируя их активность, и тем самым замедляя метаболизм и выведение других лекарственных средств из организма, вызывая токсический эффект или полное отсутствие эффекта препарата. В условиях современной полифармации важно учитывать влияние генетического полиморфизма цитохромов Р450 как на метаболизм отдельных лекарственных средств, так и на межлекарственные взаимодействия. В данной работе проведено комплексное сравнительное исследование по оценке взаимодействия различных пестицидов и противогрибковых лекарственных средств с активным центром CYP2C9*1, CYP2C9*2, CYP2C9*3 человека. Показано, что генетический полиморфизм значительно влияет на параметры связывания азолсодержащих соединений с активным центром CYP2C9. Полученные данные позволяют предсказывать межлекарственные взаимодействия, а также изменения метаболизма лекарственных средств в присутствии специфических ксенобиотиков.

Молекулярное типирование CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, CYP1A2 и MDR1 в персонализации психофармакотерапии

Accurate and reproducible techniques for determining key polymorphism of drug metabolizing CYP450 and MDR1 genes have been designed. Based on those techniques, pharmacogenetic test as well as genetic data interpretation algorithm has been developed, which allows to personalize and improve the effectiveness of psychopharmacotherapy.Разработаны точные воспроизводимые методики определения полиморфизма генов CYP 450, участвующих в биотрансформации лекарственных средств, и транспортера лекарственных средств MDR1. На основе данных методик разработан фармакогенетический тест, а также алгоритм интерпретации данных молекулярного типирования пациентов по исследуемым полиморфизмам, позволяющий персонализировать психофармакотерапию и повысить ее эффективность

Структура и функции ароматазы и ее нестероидные ингибиторы

The analysis of the structure and function of aromatase (SYP19) - enzyme from the family of cytochrome P-450 that catalyzes the aromatization of six-membered ring A of the steroidal skeleton, namely transformation of androgens into estrogens peripheral and tumor tissues in the body, has been performed, and data in its non-steroidal inhibitors have been summarized.Проведен анализ структуры и функции ароматазы (СYP19) - фермента семейства цитохромов Р-450, кодируемого расположенным на коротком плече 15-й хромосомы (локус 15q21) геном CYP19A1, катализирующего ароматизацию шестичленного цикла А стероидного скелета и обуславливающего метаболизм стероидных гормонов, а именно трансформацию андрогенов в эстрогены периферическими и опухолевыми тканями организма. Обобщены данные по ее нестероидным ингибиторам. Обсуждены особенности первичной и пространственной структуры СYP19, обуславливающие взаимодействие с мембраной клетки и субстратом, обеспечивающие транспорт последнего между липидным бислоем мембраны и активным центром фермента. Показано, что наиболее эффективными ингибиторами СYP19 в настоящее время являются соединения, содержащие в составе молекулы азольные и азиновые гетероциклические фрагменты