오배자 및 봉출 추출물의 피부 노화와 피부암에 대한 작용 메커니즘의 분자적 연구

학위논문(박사) -- 서울대학교대학원 : 농업생명과학대학 농생명공학부, 2021.8. 장판식.과도한 자외선(UV)의 노출은 피부 염증 및 피부암 발생의 주요 원인 중 하나이다. 유전적 요인과 생활습관에 따라 그 경향은 다르게 나타날 수 있지만, 반복적으로 자외선에 노출된 피부는 불규칙한 갈색 반점과 주름 형성이 나타나며, 이를 총칭하여 광노화(photoaging)라고 한다. 전사 인자 AP-1은 mmp-1과 cox-2 유전자의 발현 조절을 통해 광노화, 피부염증, 피부암의 발생에 주요한 역할을 한다. AP-1이 자외선에 의한 광노화 및 염증의 중심 매개체이기 때문에, AP-1 활성을 억제할 수 있는 화합물을 효율적으로 선별 가능한 분석 도구의 개발은 새로운 항 광노화 및 항 염증 제를 개발하기 위한 효과적인 전략이 될 것이다. 새로운 항 광노화 및 항염증 제를 선별하기 위해, MMP-1 프로모터를 인간 각질세포인 HaCaT 세포에서 안정적으로 발현되는 형질전환 세포를 구축하였으며, 항생제 선별을 통해 MMP-1 프로모터가 포함된 pGF1 벡터로 HaCaT 세포에 성공적으로 형질전환 된 것을 확인하였다. MMP-1 luciferase 분석 조건을 확립하고 infection 된 세포의 자외선에 대한 반응을 분석하기 위하여 자외선 강도와 시간에 따른 luciferase 활성을 확인하였다. 실험결과 0.04 J/cm2, 5시간에서 가장 높은 luciferase 활성을 나타내어, 향후 luciferase assay 조건으로 고정하였다. 이 세포를 이용하여, 식물 추출물 9개를 선별하였다. 그 결과, 오배자 추출물(RJE)과 봉출 추출믈이 UVB에 의하여 유도된 MMP-1 프로모터 결합 활성을 각각 80.9%, 75.8%로 억제하여 가장 우수한 광노화 억제 소재로 선별하였다. 또한, 25-100 μg/mL의 농도에서 HaCaT 세포에서 독성이 나타나지 않았다. UVB에 의하여 유도된 MMP-1 프로모터 결합 활성 및 세포 독성에 대한 다양한 RJE의 농도 별로 평가한 결과 RJE는 UVB에 의하여 유도된 MMP-1 프로모터 결합 활성을 농도 의존적으로 억제하는 것으로 나타났다. UVB에 의하여 COX-2와 MMP-1의 발현이 증가하였으며, RJE의 농도 의존적으로 COX-2와 MMP-1의 발현을 현저하게 저해하였다. 또한, RJE가 HaCaT 세포에서 UVB에 의하여 유도된 MAPKs/MAPKKs/Akt 인산화를 모든 농도에서 현저하게 억제하였다. SKH-1 무모 쥐 모델을 사용한 실험 결과에서 RJE의 경구 투여가 UVB에 의하여 생성된 주름의 형성과 마우스 피부조직에서 COX-2 및 MMP-13 발현을 유의적으로 억제하였다. 이러한 결과는 RJE가 COX-2 및 MMP-1 발현을 억제하는 강력한 항염증 및 광노화 억제제로 개발 가능성을 제시하고 있다. 또 다른 소재로, 봉출 추출물(CZE)이 HaCaT 세포에서 UVB에 의하여 유도된 COX-2 및 MMP-13 발현을 유의하게 억제하는 것을 확인하였다. Western blot 분석 결과에서 MPAKKs/MAPKs의 인산화가 CZE에 의해 억제되었다. 또한, CZE는 HaCaT 세포에서 UVB에 의하여 유도된 Akt 인산화와 EGFR 및 Src의 인산화를 유의적으로 억제하였다. SKH-1 무모 쥐 모델을 사용한 실험 결과에서는 CZE의 경구 투여는 UVB에 의하여 유도된 주름 형성과 마우스 피부조직에서 COX-2 및 MMP-13 발현을 유의하게 억제하였다. CZE에 존재하는 특정 화합물 중 커큐민은 UVB에 의하여 유도된 MMP-1 프로모터 결합 활성을 가장 높게 억제하는 효과를 나타내었다. RJE 화합물 중 syringic acid은 MMP-1 프로모터 결합 저해 활성이 가장 높게 나타났다. 따라서 syringic acid가 UVB에 의하여 유도된 피부암의 형성에 미치는 영향을 분석하였다. HaCaT세포에서 syringic acid으로 처리한 뒤, 유전자와 단백질 발현 수준을 측정하였으며, 이를 통해 syringic acid에 인한 ROS의 생성이 조절됨을 확인하였고, FDA에서 승인된 항산화제인 N-acetyl-L-systein(NAC)의 효과와 비교한 결과 유사한 저해 효과가 있음을 밝혔다. NADPH 산화 효소에 syringic acid의 영향을 평가한 결과 syringic acid가 NADPH 산화 효소의 활성을 저해함을 확인하였다. Syringic acid의 피부암 예방 가능성을 평가하기 위해 동물실험을 실시하였다. 그 결과, 만성적인 UVB 처리에 의하여 무모 쥐의 피부 종양 발생과 그와 관련된 분자의 발현을 억제하였다. Syringic acid는 NADPH 산화효소의 억제제로 작용하여 자외선에 의한 ROS 생산을 억제하고 피부암 발생을 방지하여, 천연 치료제로서의 가능성을 제시하고 있다.Excessive ultraviolet (UV) exposure can cause acute skin inflammation and chronic exposure has been linked to skin cancer. While dependent on genetic factors and lifestyle choices, repeated exposure to UV irradiation generally results in the appearance of irregular brown spots and wrinkle formation, collectively referred to as photoaging. The transcription factor AP-1 plays a critical role in these processes via regulation of mmp-1 and cox-2 gene expression, respectively. Due to the fact that AP-1 is a central mediator of UV-induced photoaging and inflammation, the development of analytical tools that efficiently screen compounds that can inhibit AP-1 activity represents a potential strategy to develop new anti-photoaging and anti-inflammatory agents. To screen effective anti-photoaging and anti-inflammatory agents, I generated immortalized human keratinocyte HaCaT cells stably transfected with an MMP-1 promoter and after selection with puromycin, I confirmed that HaCaT cells were successfully transfected with the pGF1 vector containing the MMP-1 promoter. To determine the optimal conditions needed to assess MMP-1 promoter activity, I investigated different doses of UV and incubation times. The reporter gene assay revealed that 0.04 J/cm2 and 5 h were the optimal conditions for activating the MMP-1 promoter. Using these cells, I screened 99 botanical extracts of interest. 9 botanical extracts showed UVB-induced MMP-1 promoter binding activity inhibition. Rhus javanica extract (RJE) and Curcuma zedoaria extract (CZE) were identified as the most potent anti-photoaging material, suppressing UVB-induced MMP-1 promoter binding activity by 80.9% and 75.8%, respectively. Furthermore, the viability of HaCaT cells did not show signs of cytotoxicity at 25-100 μg/mL concentrations. Evaluation of varying RJE concentrations on UVB-induced MMP-1 promoter binding activity and cell cytotoxicity revealed that RJE inhibits UVB-induced MMP-1 promoter binding activity in a dose-dependent manner. I further observed that RJE suppressed UVB-induced MAPKs and AP-1 signaling cascades in HaCaT cells. Experiments using the SKH-1 hairless mouse model revealed that oral administration of RJE significantly suppresses UVB-induced wrinkle formation, as well as COX-2 and MMP-13 expression in mouse skin. These findings suggest that RJE is a potent anti-inflammatory and anti-photoaging agent that inhibits COX-2 and MMP-1 expression. Several experiments confirmed that CZE significantly suppressed UVB-induced COX-2 and MMP-13 expression in HaCaT cells. My Western blot results showed that phosphorylation of all three MPAKK/MAPKs were suppressed by CZE. Additionally, CZE strongly suppressed UVB-induced Akt phosphorylation as well as EGFR and Src phosphorylation in HaCaT cells. Using an SKH-1 hairless mice model, I determined that CZE prevented chronic UVB-induced wrinkle formation. Immunohistochemistry and Western blot assay results showed that CZE significantly suppressed UVB-induced COX-2 and MMP-13 expression in vivo. Among the specific compounds present in CZE, curcumin was found to exhibit the strongest inhibitory effect on UVB-induced MMP-1 promoter activity. Among the RJE compounds, syringic acid exhibited the most potent inhibitory effect on MMP-1 promoter activity. I sought to investigate the inhibitory effects of syringic acid on UVB-induced skin carcinogenesis. In vitro experiment, I treated human epidermal keratinocytes (HaCaT cells) with syringic acid and measured the gene and protein expression levels. Accordingly, I detected the change in ROS due to syringic acid treatment, which was compared to the effects of the FDA-approved antioxidant drug N-acetyl-L-cysteine (NAC), which is commonly used to identify and test ROS inducers and to inhibit ROS. Since NADPH oxidases of the Nox family are important enzymatic sources of ROS, I further measured the effect of syringic acid on NADPH oxidase activity to determine the potential targets mediating its inhibitory effects. To evaluate the therapeutic potential of syringic acid, I conducted an in vivo experiment using the SKH-1 hairless mouse model that received topical treatment of syringic acid prior to UVB exposure, and compared the tumor incidence and expression of relevant molecules in the mouse skin.Chapter Ⅰ. General Introduction 1 Ⅰ-1. Introduction 2 Ⅰ-2. Skin carcinogenesis and chemoprevention 4 Ⅰ-3. Role of Noxs and its downstream signaling pathways in UV-induced skin carcinogenesis 5 Ⅰ-4. Role of EGFR and its downstream signaling pathways in UV-induced skin carcinogenesis 8 Ⅰ-5. Role of PTP-κ as Nox and EGFR signal transmitters in skin cancer 11 Ⅰ-6. Preventive botanical extracts and phytochemicals in UV-induced skin damages by NADPH oxidase regulation 13 Ⅰ-7. Preventive botanical extracts and phytochemicals in UV-induced skin damages via regulation of EGFR 17 Ⅰ-8. References 20 Chapter Ⅱ. Preventive Effect of Rhus javanica Extract on UVB-induced Skin Inflammation and Photoaging 29 Ⅱ-1. Introduction 31 Ⅱ-2. Materials and Methods 34 Ⅱ-2-1. Materials 34 Ⅱ-2-2. Sample preparation and extraction procedure 34 Ⅱ-2-3. Cell culture, UVB exposure and viability assay 35 Ⅱ-2-4. Animal experiments 35 Ⅱ-2-5. MMP-1 promoter assay 36 Ⅱ-2-6. Western blot assay 37 Ⅱ-2-7. EGFR kinase assay 38 Ⅱ-2-8. Immunohistochemical analysis 38 Ⅱ-2-9. Metabolite extraction 39 Ⅱ-2-10. Chromatograph 39 Ⅱ-2-11. Statistical analysis 39 Ⅱ-3. Results 41 Ⅱ-3-1. RJE inhibits UVB-induced MMP-1 promoter activity in HaCaT cells 41 Ⅱ-3-2. RJE inhibits UVB-induced phosphorylation of MAPKKs/MAPKs, Akt, EGFR, Src and PKD/PKCμ in HaCaT cells 43 Ⅱ-3-3. RJE inhibits UVB-induced wrinkle formation and COX-2 and MMP-13 expression in the SKH-1 hairless mouse 48 Ⅱ-3-4. Identification and quantification of phenolic compounds by LC-MS/MS and effect of RJE compounds on UVB-induced MMP-1 promoter activity 52 Ⅱ-4. Discussion 57 Ⅱ-5. Conclusions 60 Ⅱ-6. References 61 Chapter Ⅲ. Preventive Effect of Curcuma zedoaria Extract on UVBinduced Skin Inflammation and Photoaging 65 Ⅲ-1. Introduction 67 Ⅲ-2. Materials and Methods 70 Ⅲ-2-1. Materials 70 Ⅲ-2-2. Sample preparation and extraction procedure 70 Ⅲ-2-3. Cell culture, UVB exposure, and viability assay 73 Ⅲ-2-4. Animal experiments 73 Ⅲ-2-5. MMP-1 promoter assay 74 Ⅲ-2-6. Western blot assay 75 Ⅲ-2-7. Immunohistochemical analysis 75 Ⅲ-2-8. Metabolite extraction 76 Ⅲ-2-9. Chromatograph 76 Ⅲ-2-10. Statistical analysis 77 Ⅲ-3. Results 78 Ⅲ-3-1. CZE inhibits UVBinduced MMP1 promoter activity, as well as COX2 and MMP13 expression in HaCaT cells 78 Ⅲ-3-2. CZE inhibits UVBinduced phosphorylation of MAPKK/MAPK, Akt, EGFR, and Src in HaCaT cells 81 Ⅲ-3-3. CZE inhibits UVBinduced wrinkle formation and COX2 and MMP13 expression in SKH1 hairless mice 84 Ⅲ-3-4. Identification and quantification of phenolic compounds by LCMS/MS and effect of CZE compounds on UVBinduced MMP1 promoter activity 89 Ⅲ-4. Discussion 94 Ⅲ-5. Conclusions 98 Ⅲ-6. References 99 Chapter Ⅳ. Syringic Acid Prevents Skin Carcinogenesis via Regulation of Nox and EGFR Signaling 104 Ⅳ-1. Introduction 106 Ⅳ-2. Materials and Methods 109 Ⅳ-2-1. Materials 109 Ⅳ-2-2. Cell culture, UVB exposure and viability assay 109 Ⅳ-2-3. Animal experiments 110 Ⅳ-2-4. MMP-1 promoter assay 111 Ⅳ-2-5. PGE2 assay 111 Ⅳ-2-6. Western blot assay 112 Ⅳ-2-7. Measurement of ROS 113 Ⅳ-2-8. PTP-κ immunoprecipitation 113 Ⅳ-2-9. Histological analysis 114 Ⅳ-2-10. Statistical analysis 114 Ⅳ-3. Results 115 Ⅳ-3-1. Syringic acid inhibits UVB-induced COX-2 and MMP-1 expression, PGE2 production, and MMP-1 promoter activity in HaCaT cells 115 Ⅳ-3-2. Syringic acid inhibits UVB-induced phosphorylation of MAPKs, MAPKKs, and EGFR in HaCaT cells 118 Ⅳ-3-3. Syringic acid inhibits the UVB-induced oxidization of PTP-κ in HaCaT cells 121 Ⅳ-3-4. Syringic acid and NAC inhibit UVB-induced intracellular ROS generation in HaCaT cells 124 Ⅳ-3-5. Syringic acid prevents UVB-induced skin tumorigenesis in SKH-1 hairless mice 128 Ⅳ-3-6. Syringic acid inhibits UVB-induced COX-2 and MMP-13 expression in SKH-1 hairless mice 131 Ⅳ-4. Discussion 135 Ⅳ-5. Conclusions 139 Ⅳ-6. References 140 국문초록 146박

Population Pharmacokinetics and Pharmacogenetics of Tacrolimus in the Early Post-kidney Transplantation Period

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 약학과, 2013. 2. 오정미.Tacrolimus는 이식 후 거부반응 억제를 위하여 사용되는 면역억제제이다. 혈중 농도가 환자의 장기 생존율과 임상적 지표 등에 연관 있어 혈중 농도를 맞추는 것의 중요성이 익히 알려져 있으나 치료역이 좁고 개인 간 변이가 커서 이를 정확하게 예측하는 것에 어려움이 있다. Tacrolimus의 약동학에 영향 인자로 알려져 있는 것들로는 나이, 성별, 체중, hematocrit, 이식 후 기간 등의 임상 지표와 CYP3A5, ABCB1 등의 유전형이 있다. 본 연구는 성인 환자에서 신장 이식 후 초기 2주의 혈중 농도에 대해 유전형을 고려한 집단약동학 연구를 시행하여 이식 후 초기 기간의 약동학에 영향을 주는 인자를 감별하고 약물 농도 예측을 위한 모델을 개발하여, 이에 기반한 용량 제안을 하고자 하였다. 이식 후 15일까지 시행한 최저 농도치를 수집하고 이와 함께 이식 후 10-15일 사이 tacrolimus의 혈중 농도 조밀 채혈을 약물 투약 후 0.5, 1, 2, 4, 6, 12 시간 째에 시행하여 함께 분석하였다. 동일 기간에 대하여 임상적/실험실적 검사를 함께 수집하였고, 모든 연구 대상 환자에서 CYP3A5와 ABCB1 유전형을 분석하여 모델 확립에 사용하였다. 모델 개발에는 NONMEM version 6을 이용하였고, 모델 검증에는 visual prediction check와 bootstrap 2000회를 시행하였다. 연구에는 전체 122명의 환자가 포함되었고, 이 중 61명에서 조밀 채혈을 시행하였다. 데이터 분석 결과 first-order absorption and elimination을 이용한 one-compartment model로, lag time을 적용 경우에 가장 잘 설명 되었다. 모델의 집단 클리어런스(CL/F)는 20.6 L/h로 추산 되었고, 분포 용적(Vd/F)은 286 L, 흡수 상수(Ka)는 4.41 h-1로 계산 되었으며 lag time은 0.25 hr 로 고정하였다. 이식 후 기간이 증가함에 따라 tacrolimus 클리어런스는 증가하였고 CYP3A5 유전형 *3/*3을 보유한 환자는 *1을 보유한 환자군보다 tacrolimus 클리어런스가 36.7% 감소하였다. (p < 0.001) 또한 분포 용적은 체중에 비례하여 증가하는 것으로 나타났다. 본 연구는 신장 이식을 받은 한국인 환자에서 이식 후 초기에서 조밀 채혈과 최저 농도치 결과를 함께 이용하여 tacrolimus의 개인간 약동학 차이에 영향을 미치는 요인을 감별하였다. 본 연구에서 개발된 모델을 통해 보다 적합하게 tacrolimus의 용량을 예측할 수 있을 것이며, 이는 개인맞춤 약물요법의 기반이 될 것이다.요 약 i 목 차 iii List of Tables iv List of Figures v 서 론 1 연구 방법 4 연구 결과 13 고 찰 17 참고문헌 22 Tables & Figures 27 Abstract 40Maste

베이비붐세대의 은퇴후 주거안정을 위한 정책방안 연구(Housing policy directions for the retired bany-room generation in Korea)

노트 : 이 연구보고서의 내용은 국토연구원의 자체 연구물로서 정부의 정책이나 견해와는 상관없습니다

저출산 추세에 대응한 주택 및 도시정책 방향 연구(2)(Housing and urban policy strategies responding to low fertility)

노트 : 이 연구보고서의 내용은 국토연구원의 자체 연구물로서 정부의 정책이나 견해와는 상관없습니다