동일 환자 유래 원발 대장암과 복막 전이암의 exosomal miR-193a 와 let-7g가 암 전이에 미치는 영향

학위논문 (박사) -- 서울대학교 대학원 : 의과대학 의과학과, 2021. 2. 구자록.Colorectal cancer has the third highest incidence rate worldwide, and one of the various forms of colorectal cancer metastasis is metastasis to the peritoneum. A peritoneal metastasis of colorectal cancer is difficult to diagnose, and has a poor prognosis. Trans-mesothelial metastasis is a mechanism of peritoneal metastasis caused by contact with the peritoneum, and exosomes involved in cell-to-cell interaction are considered to play a crucial role in the cancer microenvironment and epithelial-mesenchymal transition. Therefore, this study tried to elucidate clinically the possibility of exosomal miRNA as diagnostic and prognostic marker. Exosomal miRNA was extracted and analyzed by miRNA microarray. The expression of exosomal miR-193a in the PTM group was lower than that of the primary CRC group, and the expression of exosomal let-7g was higher than that of the primary CRC. After selecting target genes of miR-193a and let-7g using the miRNA database, mRNA expression was confirmed for MMP16 and CDKN1A. When the mimics of these two exosomal miRNAs were treated with cell lines, both MMP16 and CDKN1A (targets of miR-193a and let-7g) decreased intracellular expression. A cell invasiveness and proliferation assay were conducted to confirm the physiological role of the miR-193a and the let-7g. Cell invasiveness and proliferation were decreased by miR-193a and increased by let-7g. The differences in expression of exosomal miR-193a and let-7g extracted from the plasma of patients were classified as cancer progression indicators. Decreased miR-193a and increased let-7g were seen as cancer progression indicator. Furthermore, the survival rate decreased in the group with low miR-193a expression and high let-7g expression. This study elucidated the possibility of using this as a diagnostic and prognostic marker for colorectal cancer by measuring the expression levels of exosomal miR-193a and let-7g in blood.대장암은 모든 암 질환을 통틀어 세계에서 세 번째로 많은 발병률을 보이고 있으며, 2035년까지 240만명 가량이 발생할 것으로 내다보고 있다. 대장암이 전이 및 재발이 되는 곳 중의 하나인 복막은 다수의 신경, 혈관과 림프관들이 연결되어 있다. 대장암이 재발하거나 전이가 일어나는 곳 중에서 두 번째로 빈번한 곳이 복막으로 알려져 있다. 대장암의 복막 전이는 다른 장기로의 전이에서 흔히 보이는 lymphatic metastasis와 복막 전이에서만 독특하게 나타나는 mesothelial metastasis로 나누어진다. 복막 전이가 일어난 대장암 세포들은 크기가 매우 작고 납작한 형태로 퍼져서 자라는 특징이 있다. 복막 전이 초기에는 computed tomography (CT)나 positron emission tomography (PET)등 시각적 진단기법으로는 파악하기가 매우 까다롭고 힘들어서 대장암이 말기까지 진행된 뒤 발견되는 경우가 많다. 최근에는 Hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (HIPEC) 과 second-look surgery를 통한 치료법이 시행되고 있으나, 예후가 좋지 않을뿐더러 복막 전이 암의 경우 대장암의 systemic therapy에도 상대적으로 강한 내성을 보이는 경향이 있다. 이러한 위험에도 불구하고 대장암이 다른 장기로 전이가 된 경우에 대한 연구는 활발히 이루어지고 있는 반면, 원발 대장암의 복막 전이에 대한 유전자적 분석에 대한 연구는 상대적으로 부족한 편이다. 대장암과 관련된 최신 연구들의 동향은 환자 혈액의 액상 생체 검사를 통해 항암제 내성, 재발 및 전이의 가능성에 대해 비교적 빠른 시간에 파악하고 대응하고자 하는 방향으로 이루어지고 있다. 액상 생체 검사의 표적 중 하나로 exosome이 있는데 exosome은 세포가 분비하는 extracellular vesicle 중 지름이 30 ~ 150 μm 사이의 vesicle로 알려져 있으며, 세포 내의 다양한 핵산 물질과 단백질을 함유하고 있다. 또한 exosome은 다양한 경로를 통해 비교적 쉽게 다른 세포 내로 흡수가 가능하여 한 세포가 분비한 exosome 내 함유 성분들이 다른 세포로 흡수되어 신호 전달 체계에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. Exosome 내의 물질 중에서 microRNA는 전체의 약 1 ~ 5%로 매우 적은 비중을 차지하는 반면, RNA를 직접적으로 억제할 수 있는 기능을 가지고 있어서, 세포의 신호 전달 체계에 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있다. 실제로 다른 암 종에서 exosomal microRNA가 암 세포 특성 변화 (epithelial-mesenchymal transition) 및 암 미세환경에 중요한 역할을 수행한다는 연구결과들이 발표되었다. 따라서 exosomal microRNA가 독특한 전이 기작을 가지고 있는 대장암의 복막 전이 과정에서 암 세포의 특성변화와 암 미세환경에 중요한 역할을 수행할 것으로 기대했으며, 따라서 동일 환자 유래의 원발 대장암과 복막 전이 암 세포주에서 유의적인 차이를 보이는 exosomal miRNA들을 발굴하여 대장암의 복막 전이 과정에서의 명확한 역할을 밝히고 나아가서 진단 및 예후를 확인할 수 있는 지표로써 임상적인 의미를 가질 가능성을 확인하고자 하는 목표로 연구를 진행하게 되었다. 동일 환자 유래 원발 대장암 세포주와 복막 전이암 세포주에서 추출한 exosomal miRNA를 microarray 기법을 통해 유의적인 차이를 보이는 miR-193a와 let-7g를 선별했다. 이들은 원발 대장암에 비해 복막 전이암에서 miR-193a의 발현은 감소했고, let-7g의 발현은 증가했다. Exosomal miR-193a와 let-7g의 표적 유전자로 각각 MMP16과 CDKN1A가 선별되었으며, qRT-PCR 기법을 통해 이들 miRNA들이 유의적으로 MMP16과 CDKN1A의 RNA 발현을 억제한다는 것을 확인했다. 생리학적인 기능을 파악하기 위해 두 miRNA들의 유사체를 세포주에 주입했으며, exosomal miR-193a에 의해 암세포의 침투능과 증식은 감소했고, exosomal let-7g에 의해 암세포의 침투능과 증식이 증가했다. 이 결과들을 바탕으로 실제 대장암 환자의 혈액에서 추출한 exosomal miRNA들로 진단 및 예후와 관련된 요소들에 따라 miRNA의 발현양을 확인했다. Exosomal miR-193a의 발현은 대장암 진행단계 높아짐에 따라 감소했으며, exosomal let-7g의 발현은 증가했다. 또한 exosomal miR-193a의 발현이 상대적으로 낮은 집단은 높은 집단에 비해 생존률이 유의적으로 떨어졌으며, exosomal let-7g의 발현이 상대적으로 높은 집단은 낮은 집단에 비해 생존률이 역시 떨어졌다. 결론적으로 대장암의 exosomal miR-193a의 발현 감소와 let-7g의 발현 증가는 세포침투능과 세포증식을 유발하여 복막 전이를 가속화 시켰고, 실제 대장암 환자의 생존률 또한 감소시켰다. 따라서 혈액을 통해 추출 가능한 exosomal miR-193a와 let-7g는 임상적으로 진단 및 예후를 판단하는 지표로써의 높은 가능성을 확인할 수 있었다.Ⅰ. Abstract i Ⅱ. Table of contents iii Ⅲ. List of tables iv Ⅳ. List of figures v Ⅴ. Introduction 1 Ⅵ. Materials and Methods 5 6.1 Cell culture 5 6.2 Human plasma samples 5 6.3 Exosome isolation 6 6.4 Exosomal miRNA extraction 7 6.5 Reverse transcription (RT) and pre-amplification 8 6.6 Quantitative Real-Time polymerase chain reaction (qRT-PCR) 9 6.7 MicroRNA mimic transfection 11 6.8 Cell invasion assay using 3D cell culture chip 12 6.9 Immunocytochemistry 13 6.10 Western blot 14 6.11 Drug sensitivity test 15 6.12 Microarray of microRNA and mRNA expression 18 6.13 Microarray raw data preparation and Statistical analysis 19 Ⅶ. Results 21 7.1 Isolation and validation of exosomal miRNA in CRC and PTM cell lines 21 7.2 MMP16 and CDKN1A as exosomal miRNA target genes 31 7.3 Metastatic role of exosomal miR-193a and exosomal let-7g 38 7.4 Analysis of multiple drug responsiveness for clinical approach 43 7.5 Multiple markers of colorectal cancer progression as exosomal miR-193a and exosomal 49 7.6 Clinical correlation of exosomal miR-193a and exosomal let-7g on colorectal cancer prognosis 55 Ⅷ. Discussion 59 Ⅸ. References 69 Ⅹ. Abstract in Korean 82Docto

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학위논문(석사)--아주대학교 경영대학원 :e-비즈니스MBA,2014. 8오늘날 사회의 특징을 설명함에 있어 빠질 수 없는 표현 중 하나로 정보화 사회를 들 수 있다. 기존 공업 중심의 사회에서는 주로 유형의 제품을 어떻게 하면 효과적으로 생산할 수 있는지가 화두였다면, 오늘날 정보화 사회에서는 무형의 정보들을 효과적으로 활용함으로써 새로운 가치를 창출하는 능력이 곧 핵심 경쟁력이 되는 시대라 말할 수 있다. 이러한 변화를 가능하게 한 것이 바로 정보시스템으로써, 정보기술의 발전과 함께 정보시스템 또한 비약적으로 성장해오고 있다. 하지만 한편으로는 기대만큼 정보시스템이 충분히 활용되지 못하고 성과가 창출되지 못하는 문제가 대두됨으로써, 무엇이 정보시스템을 수용하게 만들고 또한 성공하게 하는 지에 대한 연구는 오랜 기간 경영정보학 분야의 주요한 연구 주제이기도 하였다. 기술수용모형과 정보시스템성공모형은 이러한 연구자들의 노력에 의하여 탄생한 대표적인 이론으로써, 수많은 연구들의 이론적인 배경으로 활용되고 있다. 하지만 이 두 이론을 기반으로 하는 연구들을 살펴보면 크게 두 가지 의문을 갖게 만든다. 첫째, 대부분의 연구가 이용의도를 도출하는 것으로 종료되었으며, 궁극적으로 밝혀야 하는 실제이용까지 실증한 연구는 많지 않았다. 이러한 연구가 타당성을 확보하기 위해서는 이용의도가 실제이용을 예측하는데 있어 절대적인 요인이라는 전제가 필요하다. 하지만 이용의도와 실제이용 간의 관계를 실증한 일부 연구조차도 이용을 설문을 통하여 측정함으로써 실제이용을 정확히 반영하였다고 보기는 어려울 수 있다. 둘째, 정보시스템에 관련한 변수의 측정을 대부분 사용자의 지각된 결과에 의하여 측정하고 있었다. 하지만 인간의 선택적 지각이나 고정관념과 같은 특성으로 인하여, 이러한 방식은 실제를 정확히 반영하지 못할 수도 있다. 이와 같은 근본적인 질문에 대한 답을 찾기 위해서 본 연구에서는 사용자의 실제이용기록을 측정하여 연구에 반영하였고, 사용자의 지각이 아닌 객관적인 기준을 이용하여 측정하였다. 대상이 되는 정보시스템은 최근의 모바일 환경을 반영할 수 있는 모바일 캠퍼스 앱으로 하였고, 총 180명의 사용자에게 설문을 하였으며 동시에 정보시스템에 누적되는 사용자의 이용기록을 수집하였다. 그 결과 세가지 의미 있는 연구 결과를 도출할 수 있었다. 첫째, 지각된 이용의도는 정보시스템의 실제 사용에 정(+)의 영향을 주고 있음을 실증하였다. 하지만 설명력이 다소 낮다는 점 또한 확인하였다. 둘째, 지각된 이용의도를 매개하지 않고 실제이용에 정(+)의 영향을 주는 단말플랫폼품질이라는 새로운 요인을 발견하였다. 셋째, 지각된 시스템품질이 실제 시스템품질을 정확히 반영하지 못할 수 있음을 확인할 수 있었다. 본 연구에서는 또한 설명력이 다소 낮은 결과에 대한 원인을 파악하기 위하여, 추가적인 연구를 수행하였으며, 그에 대한 이론적인 해석과 예상되는 사항에 대하여 검토하였다.제1장 서론 11 제1절 연구의 배경 및 목적 11 제2절 연구의 대상 13 제3절 연구의 방법 및 구성 14 1. 연구 방법 14 2. 논문의 구성 15 제2장 이론적 고찰 16 제1절 기술수용모형에 대한 연구 16 제2절 정보시스템 성공모형에 대한 연구 21 1. DeLone and McLean의 정보시스템 성공모형 21 2. 시스템품질 25 3. 플랫폼품질 29 제3절 모바일 캠퍼스 앱 37 1. 모바일 앱 37 2. 모바일 캠퍼스 앱 37 제3장 연구설계 40 제1절 연구모형 40 제2절 연구가설 41 1. 단말플랫폼품질과 지각된 시스템품질 간의 관계 41 2. 지각된 유용성에 영향을 주는 요인 42 3. 지각된 이용의도에 영향을 주는 요인 43 4. 실제이용에 영향을 주는 요인 44 제3절 변수의 조작적 정의 및 측정 45 1. 지각된 시스템품질의 측정 46 2. 단말플랫폼품질의 측정 48 3. 지각된 유용성의 측정 54 4. 지각된 이용의도의 측정 54 5. 실제이용의 측정 54 제4절 자료 수집 방법과 표본의 구성 55 1. 자료 수집 방법 55 2. 표본의 구성 56 제5절 분석방법 56 제4장 실증분석 58 제1절 자료의 기초 분석 및 표본의 일반적 특성 58 제2절 변수의 신뢰성과 타당성 분석 59 1. 탐색적 요인 분석 59 2. 신뢰성 검증과 집중타당성 분석 60 3. 판별타당성 분석 61 제3절 연구가설의 검증 63 1. 단말플랫폼품질과 지각된 시스템품질 간의 관계 검증 63 2. 지각된 유용성에 영향을 주는 요인에 대한 검증 63 3. 지각된 이용의도에 영향을 주는 요인에 대한 검증 64 4. 실제이용에 영향을 주는 요인에 대한 검증 64 제4절 연구의 토의 66 제5장 결론 70 제1절 연구 결과의 시사점 70 1. 이론적인 시사점 70 2. 실무적인 시사점 71 제2절 연구의 한계 및 향후 연구 73 참고 문헌 75 ABSTRACT 85Maste