Inactivation of the OD314 Gene by RNA Interference in Preodontoblast Cell Lines

상아질모세포는 신경능선세포에서 기원하며 상아질의 유기질을 형성하는데 상아질모세포의 분화과정이 나 상아질의 형성과정과 관련한 분자생물학적 기천은 아직 명확히 밝혀져 있지 않다 OD3l4는 흰쥐의 치아발생 과정과 세포배양실험에서 상아질 형성과정 특히 석회화결절이 형성되는 시기에 그 발현이 현저하며 상아철의 석회화과정에 중요한 기능을 암시한다. 본 연구에서는 OD3l4 유전자의 발현을 RNA 1nterference를 이용하여 억제하여 상아질모세포내 다양한 유전자들의 단백질들을 평가함으로서 상아질의 형성과정에서 OD3l4의 가능을 알아보고자 하였다. 1. MDPC23 세포에 ascorblc ac1d와 B-glycelcphosphate 청가하여 석회화 경절 형성을 유도한 실험에서 배양 후 l4일에 석회화 결절이 관찰되었다 2. MDPC23 세포의 석회화 결절 형성과정에서 OD3l4, OC 및 DSPP mRNA는 배양초기부터 석회화 결절이 형성된 14일에도 동일한 발현을 보인 반면, ON mRNA는 석회화 결절이 형성되기 시작웅 F 는 7 얼부터 발현이 감소되였다. 3. MDPC23 세포의 배양과정에서 OD3l4 단백질은 17kDa정도의 크기로 배양 시작부터 7 일까지 동일한 발현을 보였으며 석회화 결절이 형성된 l4일에는 더욱 강한 발현을 보였다. 4. MDPC23 세포에 OD3l4 siRNA를 Iransfcmorn한 실험에서 OD3l4, OC, ON 및 DSPP 의 mRNA 의 발현이 감소하였고 OD3l4의 단백질 발현 또한 OD314 S1RNA를 transfecl1on한 세포에서 감소하였다. 이상의 결과를 종합하면 OD3l4가 상아질모세포의 주요 유전자들의 조절에 관여할 것으로 사료되나 이를 명확히 하기 위하여 앞으로 OD3l4에 대한 기능과 상아질모세포 관련인자들과의 상호연관성에 대한 향후 보완 연구가 필요할 것으로 사료된다. Tooth development depends on reciprocal interactions between oral epithelium and ectomesenchyme. The ectomesenchyme-derived odontoblasts secrete several collagenous and non-collagenous proteins to form a unique extracellular matrix. OD314 was obtained by subtractive hybridization between odontoblasts and osteoblast/pulp cells, and differentially or predominantly expressed in odontoblasts of rat incisors compared to osteoblasts and pulp cells. However, little is known about the function of 00314 in odontoblast differentiation. In this study, to better understand the function of OD314, we inactivated the 00314 gene in mouse MDPC23 cells using U6 promoter-driven siRNA method. After the characterization of mineralized nodule formation and molecular expression of MOPC23 cell, Inactivation effects of the 00314 were evaluated by RT-PCR and western blot. 1. Mineralized nodule formation was observed after 14 days of culture in MDPC23 cells. 2. The 00314, OC and DSPP mRNA were highly expressed throughout the cultures, while the expression of ON decreased as the MOPC23 cells differentiated. 3. The 00314 protein was weakly expressed at 7 days of culture, but increased gradually as MDPC23 cells reached mineralization stage. 4. The inactivation of 00314 by RNA interference downregulated the expressions of 00314, DSPP, OC, and ON mRNA and OD314 protein in MOPC23 cells. These results suggest that OD314 may playa important role in mineralization process of odontoblast and also regulate odontoblast-related genes such as OC, ON, and DSPP.본 연구는 한국과학재단 목적기초연구(R01-2003-000-10141-0)지원으로 수행되었음

Inactivation of the OD314 Gene by RNA Interference in Preodontoblast Cell Lines

상아질모세포는 신경능선세포에서 기원하며 상아질의 유기질을 형성하는데 상아질모세포의 분화과정이 나 상아질의 형성과정과 관련한 분자생물학적 기천은 아직 명확히 밝혀져 있지 않다 OD3l4는 흰쥐의 치아발생 과정과 세포배양실험에서 상아질 형성과정 특히 석회화결절이 형성되는 시기에 그 발현이 현저하며 상아철의 석회화과정에 중요한 기능을 암시한다. 본 연구에서는 OD3l4 유전자의 발현을 RNA 1nterference를 이용하여 억제하여 상아질모세포내 다양한 유전자들의 단백질들을 평가함으로서 상아질의 형성과정에서 OD3l4의 가능을 알아보고자 하였다. 1. MDPC23 세포에 ascorblc ac1d와 B-glycelcphosphate 청가하여 석회화 경절 형성을 유도한 실험에서 배양 후 l4일에 석회화 결절이 관찰되었다 2. MDPC23 세포의 석회화 결절 형성과정에서 OD3l4, OC 및 DSPP mRNA는 배양초기부터 석회화 결절이 형성된 14일에도 동일한 발현을 보인 반면, ON mRNA는 석회화 결절이 형성되기 시작웅 F 는 7 얼부터 발현이 감소되였다. 3. MDPC23 세포의 배양과정에서 OD3l4 단백질은 17kDa정도의 크기로 배양 시작부터 7 일까지 동일한 발현을 보였으며 석회화 결절이 형성된 l4일에는 더욱 강한 발현을 보였다. 4. MDPC23 세포에 OD3l4 siRNA를 Iransfcmorn한 실험에서 OD3l4, OC, ON 및 DSPP 의 mRNA 의 발현이 감소하였고 OD3l4의 단백질 발현 또한 OD314 S1RNA를 transfecl1on한 세포에서 감소하였다. 이상의 결과를 종합하면 OD3l4가 상아질모세포의 주요 유전자들의 조절에 관여할 것으로 사료되나 이를 명확히 하기 위하여 앞으로 OD3l4에 대한 기능과 상아질모세포 관련인자들과의 상호연관성에 대한 향후 보완 연구가 필요할 것으로 사료된다. Tooth development depends on reciprocal interactions between oral epithelium and ectomesenchyme. The ectomesenchyme-derived odontoblasts secrete several collagenous and non-collagenous proteins to form a unique extracellular matrix. OD314 was obtained by subtractive hybridization between odontoblasts and osteoblast/pulp cells, and differentially or predominantly expressed in odontoblasts of rat incisors compared to osteoblasts and pulp cells. However, little is known about the function of 00314 in odontoblast differentiation. In this study, to better understand the function of OD314, we inactivated the 00314 gene in mouse MDPC23 cells using U6 promoter-driven siRNA method. After the characterization of mineralized nodule formation and molecular expression of MOPC23 cell, Inactivation effects of the 00314 were evaluated by RT-PCR and western blot. 1. Mineralized nodule formation was observed after 14 days of culture in MDPC23 cells. 2. The 00314, OC and DSPP mRNA were highly expressed throughout the cultures, while the expression of ON decreased as the MOPC23 cells differentiated. 3. The 00314 protein was weakly expressed at 7 days of culture, but increased gradually as MDPC23 cells reached mineralization stage. 4. The inactivation of 00314 by RNA interference downregulated the expressions of 00314, DSPP, OC, and ON mRNA and OD314 protein in MOPC23 cells. These results suggest that OD314 may playa important role in mineralization process of odontoblast and also regulate odontoblast-related genes such as OC, ON, and DSPP.본 연구는 한국과학재단 목적기초연구(R01-2003-000-10141-0)지원으로 수행되었음

EXPRESSION AND FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF ODONTOBLAST-DERIVED GENE: OD314

Odontoblasts are responsible for the formation and maintenance of dentin. They are known to synthesize unique gene products including dentin sialophosphoprotein (DSPP). Another unique genes of the cells remain unclear. OD314 was isolated from the odontoblasts/pulp cells of rats and partially characterized as an odontoblast-enriched gene (Dey et al., 2001). This study aimed to elucidate the biological function of OD314, relating to odontoblast differentiation and dentinogenesis. After determining the open reading frame (ORP) of OD314 by transient transfection analysis using green fluorescent protein (GPP) expression vector, mRNA in-situ hybridization, immunohistochemistry, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and western analysis were performed. The results were as follows: 1. In in-situ hybridization, OD314 mRNAs were expressed in odontoblasts of developing coronal and root pulp. 2. OD314 was a novel protein encoding 154 amino acids, and the protein was mainly expressed in cytoplasm by transient transfection analysis. 3. Mineralized nodules were associated with multilayer cell nodules in the culture of human dental pulp cells and first detected from day 21 using alizarin-red S staining. 4. In RT-PCR analysis, OD314, osteocalcin (OC) and DSPP strongly expressed throughout 28 days of culture. Whereas, osteonectin (ON) mRNA expression stayed low up to day 14, and then gradually decreased from day 21. 5. Western blots showed an approximately 17 kDa band. OD314 protein was expressed from the start of culture and then increased greatly from day 21. In conclusion, OD314 is considered as an odontoblast-enriched gene and may play important roles in odontoblast differentiation and dentin mineralization.한국과학재단 목적기초연

Role of OD314 During Odontoblast Differentiation

상아질모세포는 상아질을 형성하고 유지하는 세포이다. 상아질모세포-특이 유전자로 널리 알려진 DSPP는 상아질의 석회화 과정에는 중요한 역할을 하나, 현재까지 DSPP 이외의 인자를 동정하고 이를 통하여 상아질모세포의 분화와 상아질의 석회화 과정을 분자생물학적으로 연구한 결과들은 거의 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 최근에 상아질의 석회화 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 OD314 유전자의 발현을 분석하고, OD314 유전자의 과발현과 발현억제가 상아질모세포의 분화에 미치는 영향을 연구하여 다음과 같은 결과를 얻었다. MDPC-23 세포의 분화과정에서 OD314 mRNA는 배양 시작부터 발현되기 시작하여 배양 21일까지 그 발현이 증가하였고, 배양 28일에도 강한 발현이 유지되었다. 면역세포형광 염색에서 OD314 단백질은 세포의 핵에서는 약하게 발현되었으나, 세포질에서 강하게 발현되었으며 특히 핵에 인접한 세포질에서 더욱 강한 발현을 보였다. 상아질모세포의 석회화 관련 유전자인 DSPP는 OD314의 발현을 억제하였을 때 발현이 현저히 증대 되었으며, ON은 OD314를 과발현 시켰을 때 발현이 감소하였다. 이상의 결과를 종합하면 OD314는 상아질모세포의 분화와 상아질의 형성 및 석회화 과정에 중요한 역할을 하는 새로운 인자로 사료된다. Odontoblasts are responsible for the formation and maintenance of dentin which is a mineralized part in dentin-pulp complex of tooth. OD314 was obtained by subtractive hybridization between odontoblasts and osteoblast/dental papilla cells, and differentiatially expressed in the odontoblasts but not in osteoblasts and dental papilla cells. In this study, to better understand the biological function of new odontoblast-enriched gene, OD314, we examined expression of OD314 in cultured MDPC-23 cells and intracellular localization of OD314 protein. We also evaluate the effect of OD314 over-expression and inactivation on the cells by northern analysis. When MDPC-23 cells are cultured in the differentiation and mineralization medium for 28 days, OD314 mRNA expression was gradually increased from the beginning to day 21 and remained relatively high on day 28. Immunofluorescent staining of cultured MDPC-23 revealed localization of OD314 on the cytoplasm, especially near the nuclear membrane. However, a small amount of fluorescence was also observed in the nucleus. Inactivation of OD314 by RNA interference up-regulated the expression of DSPP, whereas over-expression of OD314 by CMV-OD314 plasmid down-regulated the expression of ON. These results suggest that OD314, a odontoblat-enriched gene, may play important roles in the odontoblast differentiation and dentin mineralization.본 연구는 한국과학재단 목적기초연구(R01-2003-000-10141-0)지원으로 수행되었음

Effect of the Nuclear Factor I-C on the formation of Hertwig's epithelial root sheath during root development

치아의 형성은 상피-간엽간의 상호작용을 통해 조절되어지는 복잡한 발생과정이다. 지금까지 치관의 발생에 관여하는 유전자 및 그들의 신호전달경로에 관한 연구는 다수 진행되어 왔지만 치근의 발생을 조절하는 기전에 대해서는 별로 알려진 것이 없다. 최근에 NFI-C knock out 생쥐에서 정상치관에 비정상적인 치근을 가지는 치아가 보고되었다. 본 연구의 목적은 NFI-C가 어떻게 치근의 형태와 상아모세포의 분화에 관여하는지를 규명하는 것이다. NFI-C knock out 생쥐의 치근 발생동안에 HERS의 역할을 연구하고자 cytokeratin 면역조직화학적방법과 치근상아질의 특성을 규명하기 위해 DSPP mRNA in-situ hybrydization법을 수행하였다. 1. NFI-C knock out 생쥐의 치근형성시 HERS의 역할 Wild type과 knock out type 모두에서 cytokeratin은 모든 HERS 세포들과 반응하였고, HERS와 법랑상피 사이의 양성반응세포들의 연속성은 치경부 부위에서 소실되었다. Knock out type에서 치근상아질이 침착된 후, cytokeratin 양성-HERS 세포들은 치경부에서 불규칙한 배열과 극성의 상실을 보였다. 2. NFI-C knock out 생쥐의 치근상아질의 특성 DSPP mRNA의 발현은 wild type에서 치관과 치근상아질의 상아모세포 모두에서 강한 발현을 보인 반면, knock out type에서는 치관부위 상아질의 상아모세포에서만 강한 발현을 보였다. 3. NFI-C knock out 생쥐의 치근 발생과정에서 HERS는 치관으로부터 정상적인 확장을 보인 반면, 치근부위에서의 상아 모세포 분화는 실패하였다. 위의 결과들로 보아 NFI-C는 치근형성 과정에서 상아모세포 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다. Tooth formation is a complex developmental process that is mediated through a series of reciprocal epithelial-mesenchymal interactions. Several signal pathways and transcription factors have been implicated in regulating molar crown development, but relatively little is known about the regulation of root development. It was reported that NFI-C knockout mice showed abnormal root formation with normal crown. The aims of this study are to elucidate how the NFI-C regulate the determine of root shape and odontoblasts differentiation. We carried out immunohistochemistry using cytokeratin to investigate the role of Hertwig's epithelial root sheath and DSPP mRNA in-situ hybridization to conform the nature of root dentin during root development in NFI-C knockout mice. Cytokeratin reacted with all the HERS cells and the continuity of cytokeratin positive cells between the HERS cells and enamel epithelium was lost in the cervical region both wild and K/O types. After root dentin deposition cytokeratin positive-HERS cells showed irregularity and loss of polarity in the cervical region in K/O type. DSPP mRNA was strongly expressed in odontoblasts of crown and root dentin in wild type mice, whereas expression of DSPP mRNA was restricted in odontoblast of crown dentin in the K/O type. During root formation in NFI-C knockout mice, HERS normally grow out of the crown but fail to induce odontoblast differentiation in root portion. These results suggest that NFI-C may play important roles in odontoblast differentiation during root dentin formation.위 연구는 조선대학교 연구년제 해외파견(2001년) 지원에 의하여 이루어진 것임

Immunohistochemical localization of several protein changes in periodontal ligament during tooth eruption and interdental separation of rats

치아의 맹출 과정과 치간이개로 유도된 치아 및 치조골의 흡수 과정에서 치주인대 세포와 치주인대 단백질의 기능을 알아보기 위하여, 발육 중인 흰쥐를 치근 형성 전, 치근 형성 시작과 치근 형성 및 맹출 시기로 구분하여 조직 표본을 제작하고, 또한 성 장 중인 흰쥐를 2주간 치간 이개시켜 조직표본을 제작하였다. 치주인대 섬유모세포에서 특이적으로 발현되며 치주인대의 분화와 성숙에 관여하는 PDLs22단백질과 치아와 치조골의 파괴와 흡수를 조절하는 것으로 알려진 RANKL과 OPG의 발현을 면역 조직화학적으로 연구하였다. PDLs22 단백질은 치근 형성이 시작되면서부터 치낭세포와 골모세포에서 발현되어, 치아가 맹출하는 과정에서도 그 발현이 계속 유지되었으나, 치간이개에 의하여 치주인대가 개조되는 부위에서는 발현이 감소하였다. RANKL은 치근형성 과정에서는 미약한 발현을 나타내었으나, 치아가 맹출하면서 발현이 증대되었으며, 치간이개에 의한 치근과 치조골 흡수과정에서는 치주인대세포, 골모세포, 치수세포 및 파치세포에서 발현이 증대되었다. OPG는 치근이 형성되는 시기에는 강한 발현을 보였으나, 치아가 맹출하면서 발현이 현저히 감소하였고, 치아와 치조골의 흡수가 진행됨에 따라서 발현이 다소 감소하였다. In this study, we attempt to investigate the mechanisms by which PDL cells regulate osteoclast formation and also tc know whether PDL retained their characteristic phenotype during tooth eruption and interdental separation. Rats were prepared at developmental days 21 (pre-root formation), 27(toot development), 34(advanced root formation/eruption) and at later times(adult rats). To induce severe resorption state of alveolar bone and tooth root, interdental separation with brass wire was performed between the lower first and second molars for 2 weeks in adult rats. Rat mandibles were demineralized and embedded in paraffin, and horizontal and frontal section were prepared for immuno-histochemical analysis using PDL-specific protein 22 (PDLs22), receptor activator of NFKB ligand (RANKL) and osteoprotegerin (OPG) antibodies. 1. Root formation and eruption stage of tooth development. 1) PDLs22 immunolocalization was observed in tooth follicle/PDL cells and osteoblasts throught out the root formation and eruption stages of tooth development. 2) RANKL expression became stronger at eruption stage than root formation stage of tooth development. 3) Strong expression of OPG was detected in follice/PDL cells of toot formation stage but it was decreased with tooth eruption. 2. Interdental separation between lower first and second molar 1) Comparared to normal animal, multinucleated osteoclasts and odontoclasts were markedly induced in the alveolar bone and tooth root with PDL remodeling in hematoxylin-eosin section. 2) PDLs22 expression was decreased with interdental separation. 3) RANKL expression was Increased with interdental separation in PDL fibroblasts, osteoblasts, odontoclasts and it lacunae, resorting dentin, cementum and bone matrix. 4) OPG expression was slightly decreased in the PDL cells adjacent to the alveolar bone and root surface with interdental separation. These results suggested that during tooth eruption and tooth movement, RANKL and OPG in the periodontal tissues are important determinants regulating balanced alveolar bone and tooth root resorption. And it is also suggested that PDL cells retained their characteristic phenotype during tooth eruption and interdental separation except for the short period of PDL remodeling

EXPRESSION OF OD314 DURING AMELOBLAST DIFFERENTIATION AND MATURATION

법랑모세포는 법랑질을 형성하고 유지하는 세포로, 법랑질의 유기기질을 분비하고 법랑질 석회화 과정에도 관여한다. 치아 발생과정에서 법랑모세포의 분화는 순차적인 상피-간엽 상호작용에 의하여 조절되나, 분화나 성숙과정의 정확한 기전은 아직까지 잘 알려져 있지 않다. 최근에 상아모세포에서 처음 발견된 OD314가 치아 발생과정에서 상아질을 형성하는 상아모세포 뿐 아니라 법랑모세포에도 발현된다고 하였다. 이에 본 연구에서는 생쥐 하악 전치의 다양한 시기의 법랑모세포를 이용하여, 형태학적 분석과 in-situ hybridization에 의한 OD314 mRNA의 발현 그리고 OD314 항체를 이용한 면역조직화학적 분석을 통하여 OD314유전자의 법랑모세포 분화와 성숙과정에서의 역할을 연구하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 형태학적으로 법랑모세포는 분화 단계에 따라 분비 전단계 법랑모세포, 분비기 법랑모세포, 성숙기의 평탄끝 법랑모세포와 성숙기의 주름끝 법랑모세포로 구분되었다. 2. OD314 mRNA는 분비기의 법랑모세포에서부터 발현되기 시작하여 법랑모세포가 성숙해갈 수록 그 발현이 증가하였다. 3. OD314 단백질은 분비 전단계의 법랑모세포에서는 발현되지 않고, 분비기의 법랑모세포에서는 세포질에 전체적으로 발현되었다. 성숙기의 평탄끝 법랑모세포와 주름끝 법랑모세포에서는 세포의 근심과 원심끝단에 OD314 단백질이 강하게 발현되었다. 이상의 결과를 종합하여 OD314는 법랑모세포의 분화와 성숙과정에서 세포질 내부에서 특징적인 역할을 하는 것으로 사료된다. Ameloblasts are responsible for the formation and maintenance of enamel which is an epithelially derived protective covering for teeth. Ameloblast differentiation is controlled by sequential epithelial-mesenchymal interactions. However, little is known about the differentiation and maturation mechanisms. OD314 was firstly identified from odontoblasts by subtraction between odontoblast/pulp cells and osteoblast/dental papilla cells, even though OD314 protein was also expressed in ameloblast during tooth formation. In this study, to better understand the biological function of OD314 during amelogenesis, we examined expression of the OD314 mRNA and protein in various stages of ameloblast differentiation using in-situ hybridization and immunohistochemistry. The results were as follows : 1. The ameloblast showed 4 main morphological and functional stages referred to as the presecretory, secretory, smooth-ended, and ruffle-ended. 2. OD314 mRNA was expressed in secretory ameloblast and increased according to the maturation of the cells. 3. OD314 protein was not expressed in presecretory ameloblast but expressed in secretory ameloblast and maturative ameloblast. OD314 protein was distributed in entire cytoplasm of secretory ameloblast. However, OD314 was localized at the proxiamal and distal portion of the cytoplasm of smooth-ended and ruffle-ended ameloblast. These results suggest that OD314 may play important roles in the ameloblast differentiation and maturation.한국과학재단 목적기초연

EXPRESSION AND FUNCTION OF OD314, APIN PROTEIN, DURING AMELOBLAST DIFFERENTIATION AND AMELOGENESIS )

본 연구에서는 법랑모세포 분화와 법랑질 형성에 연관이 있는 OD314 일명 Apin protein의 기능을 밝힐 목적으로, in-situ hybridization에 의한 OD314 mRNA 발현과 법랑모세포 세포주에서 OD314와 enamel matrix protein의 발현, 그리고 OD314 유전자를 과발현/억제시킬 수 있는 construct를 제작한 후 법랑질 형성 중에 OD314의 기능을 알아보고자 RT-PCR를 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. OD314 mRNA는 발생중인 상아모세포보다 법랑모세포에서 강하게 발현되었다. 2. Tuftelin은 석회화 결정이 형성되는 14일까지 발현이 지속되고, 그 이후부터 점차 감소하였다. Amelogenin과 enamelin은 7일부터 그 발현이 점점 감소하였다. 3. U6-OD314 siRNA construct를 이용하여 transfection한 법랑모세포 세포주는 OD314와 tuftelin, MMP20 mRNA 발현이 감소하였으며, CMV-OD3l4를 transfection하여 OD314의 과발현을 유도한 경우에는 OD3l4와 MMP20 mRNA의 발현이 뚜렷이 증대되었다. 이 결과는 OD314가 법랑모세포의 분화와 법랑질의 형성 그리고 석회화 과정에 중요한 역할을 하는 새로운 인자임을 시사한다. This study was aimed to elucidate the biological function of OD314 (Apin protein), which is related to ameloblast differentiation and amelogenesis. Apin protein, calcifying epithelial odontogenic (pindborg) tumors (CEOTs)-associated amyloid, were isolated from CEOTs, and has similar nucleotide sequences to OD314. We examined expression of the OD314 mRNA using in-situ hybridization during tooth development in mice. Expression of OD314 and several enamel matrix proteins were examined in the cultured ameloblast cell line up to 28 days by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) amplification. After inactivation and over-expression of the OD314 gene in ameloblast cell lines using U6 vectordriven RNA interference and CMV-OD314 construct, RT-PCR were performed to evaluate the effect of the OD314 during amelogenesis. The results were as follows: 1. In in-situ hybridization, OD314 mRNAs were more strongly expressed in ameloblast than odontoblast. 2. When ameloblast cells were cultured in the diffcrentiation and mineralization medium for 28 days, the tuftelin mRNA expression was maintained from the beginning to day 14, and then gradually decreased to day 28. The expressions of amelogenin and enamelin were gradually decreased according to the ameloblast differentiation. 3. Inactivation of OD314 by U6-OD314 siRNA construct down-regulated the expression of OD314, MMP-20, and tuftelin, whereas over-expression of OD314 by CMV-OD314 construct up-regulated the expression of OD314 and MMP-20 without change in tuftelin. These results suggest that OD314 is considered as an ameloblast-enriched gene and may play the important roles in ameloblast differentiation and mineralization.한국과학재단 특정기초연

Morphological Differences of the Wound Healing in Secretory Leukocyte Protease Inhibitor Knockout Mice

분비백혈구단백분해효소억제제(secretory leukocyte protease inhibitor, SLPI)는 세린계열의 단백분해 억제제로 점액에서 주로 발견되며 항미생물 작용을 지니고 있다. SLPI는 약 12kD의 분자량을 지니며 아교질과 fibronectin과 같은 구조 단백질의 과도한 분해를 억제한다. 손상된 조직의 치유는 과도한 단백질의 분해와 박테리아의 감염을 특징적으로 지니고 있으므로 상처의 치유가 느리게 진행된다. 이에 Slpi 유전자가 결손된 생쥐를 이용하여 피부에 상처를 유도한 후 1, 3, 5, 7일째에 조직을 적출하여 다양한 조직화학적 염색법과 면역조직화학적 방법 및 RNase protection 방법 등을 이용하여 상처치유과정을 분석하였다. 조직학적인 분석결과 상처 유도 후, Slpi 결손 생쥐의 적출된 모든 피부조직에서 회복과정이 대조군의 생쥐에 비해 느렸으며, 다수의 염증반응세포들이 장기간 상처부위에 남아 있었다. 또한, Slpi 결손 생쥐에서 아교질의 침착이 느리게 진행되었으며 조직 장력 역시 낮은 것으로 확인되었다. RNase protection 결과로 발현되는 사이토카인 중 TGF-β1의 발현이 Slpi 결손 생쥐에서 증가되었다. 이러한 결과를 종합해 보면 SLPI는 피부의 상처회복에서 상피세포의 이동, 염증반응세포의 유입조절 등에 관여할 것으로 생각된다. Secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI) is a serine protease inhibitor with anti-microbial properties found in mucosal fluids. At the tissue level, the ability of this 12kDa protein is to counteract the excessive degradation of functional and structural proteins such as collagen and fibronectin. Impaired healing states are characterized by excessive proteolysis and often bacterial infection, leading to the hypothesis that SLPI may have a role in this process. To investigate the role of SLPI in skin how it contributes to tissue repair, we have generated mice null for the gene encoding SLPI (Slpi), which show impaired cutaneous wound healing with increased inflammation. For the purpose of this, we have performed wound experiment in skin tissue with morphometrical analyses, immunohistochemistry, and Rnase protection assay. From these analyses, the results were that delayed healing in KO mice wounds compared to that of WT, prolonged inflammatory phase and increased TGF-β1 in KO wounds, and lower mechanical properties in KO wounds. Taken together, SLPI may play a cruical role in cutaneous wounds healing especially in matrix reorganization that suggests the development as a clinical drug for wound healing.이 논문은 정부재원(교육인적자원부 학술연구조성사업비)으로 한국학술진흥재단의 지원을 받아 연구되었음(R08-2003-000-10279-0)

Differential Expression of System L Amino Acid Transporters in Wound Healing Process of Rat Skin

상처치유 과정에는 계속적인 세포성장과 증식이 필수적이며, 이러한 과정에 영양물질 수송체의 역할은 필수적이라고 할 수 있다. 아미노산 수송계 L은 중성아미노산을 수송하는 세포막 단백질로서 종양세포를 포함한 대부분의 세포에서 중성아미노산의 주 경로가 되는 아미노산 수송계로 알려져 있다. 본 연구는 상처를 유발시킨 흰쥐를 이용하여 상처치유 과정에서 아미노산 수송계 L의 발현양상 및 역할을 밝히고자 하였다. 동일조건 하에서 일정기간 사육한 흰쥐의 피부에 상처를 유발시킨 후, 12시간, 1일, 3일, 5일, 7일째에 조직을 적출하여 역전사-중합효소 연쇄반응과 면역조직화학적 분석 등을 이용하여 상처치유 과정에서 아미노산 수송계 L의 발현을 분석하였다. LAT1의 발현은 상처유발 후 12시간째에 증가가 있었으며, 1일, 3일, 5일 및 7일째로 경과하면서 대조군과 점차 유사해졌다. LAT2의 발현은 상처유발 후 1일과 3일까지 증가하였으며, 5일과 7일째로 경과하면서 대조군과 점차 유사해졌다. 본 연구의 결과로서 중성아미노산 수송계 L 중, LAT1은 세포손상 후 상처치유과정의 초기단계에서 중요한 역할을 하며, LAT2는 상처치유 기간에서 점차 정상으로 진행되어가는 중기단계에서 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.한국과학재단 목적기초연구(R01-2005-000-10135-0