Improving genome-wide specificity and targeting-scope of CRISPR RNA-guided base editing

학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 자연과학대학 화학부, 2019. 2. 이연.Over the past few years, developments of applications in the CRISPR-Cas9 system have increased explosively, not only for efficient genome engineering but also for recruiting variety range of functional domains at a target locus. In the presence of an exogenous DNA template with homologous sequence, point mutations can be introduced at Cas9 nuclease-mediated DSBs by homology-directed repair (HDR), one of endogenous cellular repair mechanism. However, the efficiency of HDR is modest since competitive non-homologous end joining (NHEJ) pathway is predominant. Also, it has large variations on the cell type. Recently developed base-editing systems present a useful orthogonal strategy for manipulating nucleotide substitutions. CRISPR RNA-guided base editors, fusion proteins consist of a catalytically defective Sterptococcus pyogenes Cas9 and deaminases, convert single-nucleotide in the target DNA. Base editing systems are divided into two categories: cytosine base editors (CBEs) that convert C to T and adenosine base editors (ABEs) that convert A to G. Unlike programmable nucleases which produce small indels at a target site, base editing systems have the advantage that can induce base conversions, not relying on the DSB repair pathway. Despite broad interest in base editing, genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided base editors remain unknown. Several methods for off-target detection are establishedhowever, existing methods are based on capturing of DSBs, and they are not suitable for programmable deaminases. In this thesis, I will describe a new method for assessing genome-wide specificities of CRISPR RNA-guided base editing by modifying Digenome-seq. I validate off-targets of CBEs and confirm that CBEs are highly specific compared to CRISPR nucleases. To reduce the off-target effects, I use modified sgRNAs and observe that both extended and truncated sgRNAs improve the specificities of CRISPR RNA-guided base editors. Furthermore, extended sgRNAs show base editing in additional nucleotides at positions out of canonical base editing windows, demonstrating the expansion of targeting-scope of CRISPR RNA-guided deaminases.지난 몇 년 동안, CRISPR-Cas9 기술은 유전체 교정 연구뿐만 아니라 원하는 위치에 특정 기능을 도입할 수 있는 방법으로 개발되어 왔다. Cas9 유전자 가위에 의해 DNA 이중가닥 절단이 일어나고 유사한 염기 서열을 갖는 외부 DNA가 존재하면, 세포 내 DNA 이중가닥 절단 복구 메커니즘 중 하나인 상동 재조합 방법을 통해 점 돌연변이를 유도할 수 있다. 그러나 상동 재조합 기작과 경쟁적으로 작동하는 비상동성 말단 접합이 우세하기 때문에 세포 내에서 점 돌연변이를 유도할 수 있는 상동 재조합의 효율은 상대적으로 낮고, 세포 유형에 따라 상동 재조합의 효율이 다르게 나타난다. 이러한 제한점을 넘어 최근에 개발된 CRISPR 염기교정 유전자 가위는 염기 치환을 할 수 있는 새로운 방법을 제시하였다. 염기교정 유전자 가위는 DNA 이중가닥 절단 활성에 결함이 있는 Sterptococcus pyogenes Cas9 (dCas9 또는 nCas9) 과 단일 염기를 바꿀 수 있는 deaminase를 연결하여 만든 재조합 단백질이다. 염기교정 유전자 가위에는 시토신을 티민으로 치환 가능한 시토신 염기교정 유전자 가위와 아데닌을 구아닌으로 바꿀 수 있는 아데닌 염기교정 유전자 가위가 있다. 특정 위치에 이중가닥 절단을 일으켜 변이를 유도하는 유전자 가위들과는 다르게, 염기교정 유전자 가위는 DNA 이중가닥 절단 복구 메커니즘에 의존하지 않고 원하는 염기를 바꿀 수 있다. 이러한 큰 장점에도 불구하고, 아직까지 염기교정 유전자 가위의 게놈 전반에 걸친 표적 특이성에 대해서는 밝혀진 바가 없었다. 이 연구에서는 보고된 DNA 이중가닥 절단이 일어난 곳을 확인할 수 있는 방법 중 하나인 Digenome-seq을 변형하여 시토신 염기교정 유전자 가위의 특이성을 확인하고자 하였다. 인위적으로 이중가닥 절단을 유도하기 위하여 DNA에 시토신 염기교정 유전자 가위와 함께 우라실을 특이적으로 자를 수 있는 효소들을 함께 처리하였다. 그 후, 게놈 전반에서 나타나는 시토신 염기교정 유전자 가위의 비표적 효과들을 확인하였고, 기존의 유전자 가위와 비교하여 시토신 염기교정 유전자 가위가 훨씬 정교하다는 것을 알 수 있었다. 관찰된 비표적 효과를 줄이기 위하여 가이드 RNA의 길이를 줄이거나 말단에 구아닌 염기를 추가하여 길이를 늘려보았고, 변형된 가이드 RNA를 이용하면 전반적으로 특이성이 향상됨을 확인하였다. 나아가 길이를 연장시킨 가이드 RNA를 사용한 시토신 또는 아데닌 염기교정 유전자 가위는 기존 염기 작동 범위보다 PAM으로부터 먼 부위에서도 작동할 수 있었다. 결과적으로 염기교정 유전자 가위의 변형된 가이드 RNA를 이용하면 염기교정 유전자가위의 정확성과 범용성을 개선할 수 있음을 입증하였다.Abstract i Table of Contents iii List of Figures v List of Tables viii Ⅰ. Introduction 1 Ⅱ. Materials and Methods 8 1. Cell culture and transfection conditions 8 2. Purification of base editor protein 9 3. In vitro transcription of sgRNAs 10 4. Base editor and USER treatment of a PCR amplicon 10 5. Base editor and USER treatment of genomic DNA 11 6. Whole genome sequencing and digenome sequencing 11 7. Targeted deep sequencing 12 8. ABE mRNA preparation 13 9. Animals 13 10. Microinjection of mouse zygotes 13 11. Statistical analysis 14 Ⅲ. Results 16 1. Editing efficiency and mismatch tolerance of BE3 are independent of Cas9 16 a. Indel efficiencies of Cas9 nucleases and base-editing efficiencies of base editors 16 b. Tolerance of BE3 and Cas9 for mismatched sgRNAs 19 2. Digenome-seq to identify BE3 off-target sites in human the genome 23 a. DSB generation of BE3-treated-DNA for Digenome-seq analysis 23 b. Genome-wide off-target sites of BE3 revealed by Digenome-seq 30 3. Validation of genome-wide BE3 off-target sites 44 4. Reducing BE3 off-target effects via modified sgRNAs 56 5. Extended sgRNAs broaden the base editing window 65 a. Base-editing efficiencies of cytosine base editor with extended sgRNAs 65 b. Base-editing efficiencies of adenine base editor with extended sgRNAs 70 6. Adenine base editing in mice using extended sgRNA 78 Ⅳ. Discussion 88 References 92 Abstract in Korean 105Docto

뇌실막종의 분자형에 따른 분류와 Ki-67의 예후 예측력

학위논문(박사) -- 서울대학교대학원 : 의과대학 의학과, 2022. 8. 박성혜.Although ependymomas (EPNs) have similar histopathology, they are heterogeneous tumors with diverse immunophenotypes, genetics, epigenetics, and different clinical behavior according to anatomical locations. We reclassified 141 primary EPNs from a single institute with immunohistochemistry (IHC) and next-generation sequencing (NGS). Supratentorial (ST), posterior fossa (PF), and spinal (SP) EPNs comprised 12%, 41%, and 47% of our cohort, respectively. Fusion genes were found only in ST-EPNs except for one SP-EPN with ZFTA-YAP1 fusion, NF2 gene alterations were found in SP-EPNs, but no driver gene was present in PF-EPNs. Surrogate IHC markers revealed high concordance rates between L1CAM and ZFTA-fusion and H3K27me3 loss or EZHIP overexpression was used for PFA-EPNs. The 7% cut-off of Ki-67 was sufficient to classify EPNs into two-tiered grades at all anatomical locations. Multivariate analysis also delineated that a Ki-67 index was the only independent prognostic factor in both overall and progression-free survivals. The gain of chromosome 1q and CDKN2A/2B deletion were associated with poor outcomes, such as multiple recurrences or extracranial metastases. In this study, we propose a cost-effective schematic diagnostic flow of EPNs by the anatomical location, three biomarkers (L1CAM, H3K27me3, and EZHIP), and a cut-off of a 7% Ki-67 labeling index.뇌실막종(ependymomas, EPNs)은 유사한 조직형을 가지고 있지만, 해부학적 위치, 면역표현형, 유전학, 후성유전학적 특성에 따라 다양한 임상 양상을 보이는 종양이다. 본 연구에서는 면역조직화학 및 차세대 염기서열분석(NGS)을 사용하여 단일 기관에서 141례의 뇌실막종을 재분류하였다. 천막상(ST: supratentorial), 후와(PF: posterior fossa) 및 척수(SP: spinal) 뇌실막종은 각각 우리 코호트의 12%, 41% 및 47%를 차지하였다. 융합 유전자는 ZFTA-YAP1 융합이 있는 척수뇌실막종 1례를 제외하고 천막상뇌실막종에서만 발견되었으며, NF2 유전자 돌연변이는 척수뇌실막종에서 발견되었다. 이미 알려진 바와 같이 후와뇌실막종에서는 드라이버 돌연변이는 발견되지 않았다. 면역 마커인 L1CAM양성과 ZFTA-융합 사이에서는 높은 일치율이 관찰되어 L1CAM은 ZFTA-융합을 예측하는 좋은 면역 마커임을 확인했다. 후두A형-뇌실막종은 H3K27me3 소실 또는 EZHIP 과발현의 면역표현형을 보였으며 이 두 개의 마커는 서로간 높은 상관관계를 보였다. 뇌실막종의 모든 해부학적 위치에서 Ki-67의 7% 컷오프는 두개의 등급으로 분류하기에 충분한 기준임을 발견하였다. 또한 다변수 분석을 통해 Ki-67 지수가 전체 생존 및 무진행 생존을 반영하는 유일한 독립적인 예후 인자임을 확인하였다. 염색체 1q의 증가 및 CDKN2A/2B 결실은 다발성 재발 또는 두개 밖으로의 전이와 같은 불량한 예후와 통계학적으로 의미가 높은 상관관계를 보였다. 이러한 연구 결과를 바탕으로, 우리는 해부학적 위치, 3개의 바이오 마커인 L1CAM, H3K27me3 및 EZHIP 및 Ki-67 표지 지수의 7% 컷오프를 이용하는 뇌실막종의 효율적인 도식적 진단 흐름을 제안한다.Abstract 1 Contents 5 List of abbreviations 6 List of tables 7 List of figures 8 Introduction 9 Material and Methods 16 Results 24 Discussion 50 Conclusion 55 References 58박

Physiological monitoring and suggestions on workwear improvement for parcel delivery drivers in South Korea

학위논문(석사) -- 서울대학교대학원 : 생활과학대학 의류학과, 2023. 2. 이주영.지난 몇 년간 택배 기사는 산업재해를 비롯하여 과로사가 보고되었음에도 불구하고 대부분 특수형태근로종사자로 분류되어 업무상 질병현황을 파악하기 어렵고 정확한 과로사 원인을 규명하기 힘들다. 뿐만 아니라 업무 중 작업자를 부상으로부터 보호할 전용 작업복이나 안전장치와 같은 개인보호구가 개발된 바 없으며 관련 규정 또한 없는 실정이다. 이에 본 연구는 첫째, 실제 택배 기사의 일일 현장 작업 동안 인체 생리적 부담을 정량화하고 둘째, 생리적 부담을 경감하고 산업재해를 예방할 수 있는 작업복 개선방안을 도출하고자 하는 것을 목표로 했다. 본 연구에는 두 개의 물류센터, 총 40인의 현직 남성 택배 기사가 참여하였다. 심부온, 심박수, 요비중, 체중 변화량 등의 인체 생리 반응을 측정하고 심층 면접을 통해 작업환경과 작업복 개선방안에 대해 조사하였다. 생리적 부담을 정량화하여 분석한 결과, 과반의 참여자가 온열 질환 가이드라인 역치 범위를 넘어섰음을 확인하였다. 택배기사의 의복 결정요인은 안전과 건강보다는 업무동작적합성이며 본 연구에서 이들의 생리적 부담이 높음을 확인한 바, 업무에 방해되지 않으면서 작업자의 안전과 건강을 보호하는 작업복 개발이 필요함을 확인했다. 본 연구의 데이터는 작업-휴식 사이클, 개인보호구 착용 등 안전한 작업환경을 위한 가이드라인 개발의 기초자료로 활용될 수 있다.In the past few years, parcel delivery drivers in South Korea have been reported to die from overwork. However, the exact cause of the deaths as well as industrial accidents has not been thoroughly investigated due to lack of a health tracking system for those workers. In addition, personal protective equipment such as work clothing and safety devices has not been developed to protect workers from injuries and there is no related regulation. Therefore, this study first aims to quantify the physiological strain of delivery drivers during their shifts and second, to suggest improvements on work clothing which would lead to reducing the physiological burden and preventing industrial accidents. Forty male delivery drivers from two work sites participated in this study. Body core temperature, heart rate, urine specific gravity and body mass change were measured. Work environment, injury experience and opinions on work clothing improvement were investigated through in-depth interviews. As a result of quantifying and analyzing the physiological responses, the majority of participants exceeded the threshold suggested in the thermal disease guidelines. The workers decided their clothing based on work suitability rather than safety and protection. Therefore, it is necessary to develop work clothing that not only protects workers' safety and health but also would not adversely affect their work mobility and productivity. The results of this study can be used to develop guidelines for a safe working environment, including optimal work-rest cycles and personal protective equipment recommendations.제1장 서론 1 제2장 방법 4 제1절 연구설계 4 제2절 피험자 4 제3절 작업환경 7 제4절 측정 및 조사항목 7 제5절 데이터 분석 10 제3장 결과 11 제1절 작업환경 및 실태 11 제2절 인체생리반응 및 업무 중 관련 경험 조사 13 1. 심부온 13 2. 심박수 16 3. 요비중 19 4. 체중 변화량 20 5. 업무 중 행동 및 경험 조사 21 제3절 작업복 25 1. 작업복 착의실태 및 항목별 개선요구사항 25 1) 택배 기사 착용의복 및 기기 25 2) 업무 중 부상 및 보호대/안전장치 착용 26 3) 항목별 불만 및 개선요구사항 27 ① 조끼 27 ② 작업장갑 28 ③ 안전화 30 ④ 강수 관련 31 2. 웨어러블 기기 도입 32 제4장 논의 34 제1절 택배 기사의 생리적 부담 및 직업성 부상 위험 34 제2절 개인보호구 및 웨어러블 기기 37 제3절 한계점 39 제5장 결 론 41 참고문헌 42 Appendix 44 Abstract 48석

A Study on Art Works for Mutually Productive Relations between Art and Daily Life

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 미술대학 서양화과, 2018. 8. 오인환.본 연구는 2014년에서 2017년까지의 내 작업의 목적을 미술과 일상에 대한 상호 생산적 관계 형성으로 보고 그러한 관계 형성 방법을 장소성 분석과 개인 행위의 결합이라는 작업 구조를 통해 설명한다. 미술과 일상의 상호 생산적 관계란 미술과 일상이 서로 끊임없이 상호적으로 영향을 주고받는 과정을 통해, 각각이 이전과는 다른 의미로 확장, 재발견될 수 있는 상태에 있는 것을 말한다. 미술과 일상의 이러한 관계는 관념적인 영역에서 자동적으로 형성되는 것이 아니며, 각 개인의 경험을 통해 만들어지는 것이다. 나는 미술과 일상의 관계를 형성하는 개인의 구체적이고 직접적인 경험을 포착함으로써 개인이 자신의 의지와 필요에 따라 양자의 관계를 능동적으로 조율하고 창조해낼 수 있는 가능성을 보여주려 했다. 미술과 일상의 관계에 대한 관심은 미술 작가와 일상 노동자인 나 자신의 이중적 경험과 정체성에 대한 인식에서 출발하였다. 나는 미술을 시작한 이후 작업과 생계 유지를 위한 비용을 마련하기 위해 끊임없이 일을 해왔다. 한정된 시간적, 물질적 조건 하에서 창작과 일을 병행해야만 하는 상황은 미술과 일상의 활동을 조율하고 나아가 양자 사이에 유의미한 관계를 발견해야할 필요성을 느끼게 해주었는데, 이것이 바로 작업을 통한 미술과 일상의 상호 생산적 관계 형성이라는 목표로 이어졌다. 나의 작업들은 장소의 성격인 장소성에 대한 분석과, 개인의 참여 및 협업 행위를 통한 미술과 일상의 상호 생산적 관계 형성을 추구하고 있다. 나는 모든 장소에는 장소의 의미와 성격, 질서를 규정하는 지배적 장소성과 그 이면의 다층적 장소성이 존재하며, 장소 안의 개인은 지배적 장소성의 강제력과 영향력 안에 놓인다고 보았다. 미술과 일상 중 어떤 성격이 지배적으로 나타나느냐에 따라 미술관, 미술 대학, 갤러리는 미술적 장소가, 집, 직장, 공원 등은 일상적 장소가 될 수 있다. 나는 이러한 미술/일상적 장소를 미술과 일상의 관계를 다루기 위한 작업의 무대로 삼고자 했다. 개인은 장소가 행사하는 강제력의 영향을 받지만, 특정한 행위를 통해 지배적 장소성을 변화시키거나 새로운 장소성을 만들어 낼 수 있다. 작업은 이처럼개인이 장소성에 능동적인 영향을 끼치는 행위를 통해 미술과 일상의 관계를 직접 만들어 나가는 과정을 포착하고자 했다. 개인의 서로 다른 경험을 다루는 나의 작업들은 일반적인 참여미술과는 달리 제한된 범위의 참여자와 함께 협업적으로 작품을 완성해 나가는 방식을 선택하고 있다. 개인은 작업에서 미술/일상적 장소의 위로부터의 강제력에 저항하면서도, 완전히 일탈적이지는 않은 교묘한 전술적 행위를 통해 미술과 일상의 의미가 교차하는 자신만의 장소성을 만들어낸다. 결과적으로 작업의 작가인 나, 참여자, 관객이라는 세 층위의 개인들은 저마다의 상호 생산적 관계를 형성하는 서로 다른 경험을 하게 된다. 작업에 참여하거나 작품을 감상한 각 개인들이 상호 생산적 관계의 경험에 어떤 의미를 부여했는지는 작품이 직접적으로 포착하고 있지 않은 부분이다. 이것을 내 작업의 한계로서 지적할 수도 있을 것이다. 하지만 작업의 중요한 목표는 미술과 일상의 관계를 개인의 미시적 관점에서 주목하고 그 생산적 가능성을 계속해서 강조하는 것이다. 참여/협업 미술로서의 나의 작업에 대한 비판적인 성찰과 함께 참여자의 경험을 작품에 담아내는 방식은 앞으로의 작업에서 꾸준히 고민되어야할 부분일 것이다. 이러한 연구와 고민이 향후 미술과 일상에 대한 한층 진일보한 작업의 받침대가 되어줄 수 있기를 바란다.목 차 서론················································································································1 1. 미술과 일상의 상호 생산적 관계····························································10 1.1. 미술과 일상의 분리와 연결······························································10 1.2. 상호 생산적 관계·············································································16 2. 장소성의 분석과 활용············································································19 2.1. 지배적 장소성과 장소의 다층성·······················································19 2.2. 미술적 장소(성)와 일상적 장소(성)··················································22 3. 참여적 행위와 협업의 체계····································································32 3.1. 협업의 조건과 참여자의 범위··························································32 3.2. 능동적 행위 주체인 개인·································································34 3.3. 작가, 참여자, 관객의 상호 생산적 관계 경험···································39 결론···············································································································47 도판목록·········································································································52 참고문헌·········································································································55 Abstract·········································································································58Maste

Relationships between WBGT and Heat-stress Cognition and Thermoregulatory Behavior of Seoul and Busan Residents in Summer

The purpose of the present study was to investigate relationships between Wet-bulb globe temperature (WBGT), subjective perception and thermoregulatory behavior of residents in Seoul and Busan during summer. A total of 2,652 adults (1,327 in Seoul and 1,325 in Busan) participated in the six times of surveys with an identical questionnaire from June to August, 2021. WBGT was measured in Seoul and Busan six times on the same days as the survey conducted. WBGT was 28.3 ± 2.7oC in Seoul and 27.8 ± 2.4oC. Globe temperature was higher in Seoul than in Busan, while air humidity was higher in Busan than in Seoul. Residents in Seoul felt more thermally uncomfortable to temperature rise compared to residents in Busan. There was not a big difference in air temperature to be perceived as hot weather between residents in Seoul (30.4 ± 2.6oC) and in Busan (29.7 ± 2.5oC). Also, no differences in self-identified heat tolerance, clothing insulation in summer, and thermoregulatory behaviors to heat stress between residents in Seoul and Busan. In summary, the difference in the relationship between WBGT and thermal comfort which were measured on the WBGT-recorded days in Seoul and Busan indicated the difference between continental and marine climates, while no difference was found in thermoregulatory behavior or usual cognition to thermal environments between two cities. These results suggest that the impact of summer weather on human adaptation to heat was waned due to indoor air-conditioning systems in summer spread out in two cities.N