PacBio SMRT 염기서열분석 기술 기반 Monascus ruber 대상 CRISPR/Cas9 시스템 개발

학위논문(석사) -- 서울대학교대학원 : 국제농업기술대학원 국제농업기술학과, 2021.8. 칼루.The genus Monascus has been used in the production of food components, natural pigments, and food supplements with positive effects on human health. As a result of beneficial effects, secondary metabolites produced by Monascus spp. have received worldwide attention and used industrially in recent years. It has been proved that Monascus spp. can synthesize various secondary metabolites: Monascus pigments, monacolin K, and citrinin. Monascus pigments have been used as natural food colorants and possess a wide range of biological functions. In addition, monacolin K lowers cholesterol by inhibiting HMG-CoA reductase. Even though Monascus spp. produce beneficial secondary metabolites, some strains can secrete citrinin, which has been found to be nephrotoxic, hepatoxic, and carcinogenic. Thus, the Monascus fermented food products have been concerned and controversial. With the advance of fungal metabolic engineering, the formation of secondary metabolites in filamentous fungi could be regulated by genetic engineering. The aim of this study was to establish CRISPR/Cas9 system in Monascus spp. based on PacBio SMRT sequencing. In Chapter 2, the whole genome sequence of Monascus ruber was generated. The total length of 25.9 Mb was obtained using PacBio RSII sequencer with de novo assembly. As a result of genome assemblies with long reads from PacBio SMRT sequencing, the whole genome sequence of M. ruber consisted of 13 contigs with 9,639 predicted genes. Furthermore, citrinin biosynthetic gene clusters were mostly lost, while beneficial secondary metabolites, monacolin K and Monascus pigments, biosynthetic gene clusters were present in M. ruber, indicating this strain serves as a promising industrial strain without citrinin production. To validate M. ruber could be characterized as a citrinin-free strain, HPLC analysis was performed and citrinin was not detected in M. ruber. With the genetic analysis of the function of biosynthetic related gene clusters, comprehensive insight into secondary metabolites of Monascus spp. was discussed in Chapter 2. In Chapter 3, CRISPR/Cas9 system was established in M. ruber to precisely engineer MpigI and MpigI’, putative negative transcriptional regulators. In vitro transcribed sgRNAs were adopted for transformation in the Cas9 expressed transfomrants to target MpigI and MpigI’. Based on Sanger sequencing results, six putative mutants were obtained. The mutants generated from the Cas9-mediated cleavage with dual sgRNAs were able to produce increased Monascus pigment production compared to the wild-type strain since induced-downregulation of MpigI and MpigI’ leads the increase in Monascus pigment production. Further analysis of mutants validated that CRISPR/Cas9 system was successfully established in M. ruber. This study was the first report of CRISPR/Cas9 system in M. ruber.홍국균은 인간의 건강에 긍정적인 영향을 주는 식품 보조제로 오랜 기간 동안 사용되고 있다. 홍국균이 생산하는 대표적인 2차 대사산물은 모나콜린 케이, 홍국색소, 시트리닌이 있다. 모나콜린 케이는 스타틴으로써 HMG-CoA 환원효소로 간에서 합성되는 콜레스테롤 합성을 억제하여 고지혈증 치료제로 사용된다. 홍국색소는 단백질과의 착색력이 좋아 식품의 천연색소로서 다양한 산업에서 널리 이용되고 있다. 또한, 홍국색소는 천연색소 기능뿐만 아니라 항염 및 항산화 효과가 있다고 알려져 왔고 건강기능식품으로도 주목받았다. 본 논문에서는 PacBio SMRT 시퀀싱 기술을 기반으로 한국 전통 장류 식품에서 분리한 M. ruber의 홍국색소 생산량을 높이기 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 적용하였다. Chapter 2에서는 PacBio RSII 시퀀서와 de novo 어셈블리를 사용하여 총 길이 25.9 Mb로 이루어진 M. ruber의 유전체를 얻었다. PacBio SMRT 시퀀싱을 통해서 얻어낸 어셈블리 결과, M. ruber는 9,639개의 유전자를 포함한 13개의 contig로 구성되어 있었다. 2차 대사산물에 관여하는 유전자를 분석한 결과, 시트리닌 합성 유전자는 대부분 손실되었고, 유익한 2차 대사산물인 모나콜린 케이와 홍국색소 유전자가 존재하였다, 이는 M. ruber가 시트리닌 생산이 없는 유망한 산업 균주로 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. Citrinin 생성 유무를 정확히 확인하기 위해 HPLC 분석을 수행하였고, 최종적으로 M. ruber에서 citrinin이 검출되지 않았다. Chapter 3에서는 negative regulator로 추정되는 MpigI와 MpigI'’에CRISPR/Cas9 시스템을 적용하였다. 효과적인 유전자 교정으로 mutation을 유도하기 위해 두 개의 sgRNA를 타겟 유전자에 상보적인 염기서열로 설계했다. 플라스미드 벡터로 운반된 Cas9과 in vitro로 합성된 sgRNAs는 형질전환을 통해 타겟 유전자를 교정했다. Sanger 시퀀싱 결과를 바탕으로 최종적으로 6개의 mutants가 생성되었다. Mutation이 유도된 M. rube가 wild-type에 비해 홍국색소 생산성이 높아진 것을 확인하였다. Mutants에 대한 추가 분석을 통해 CRISPR/Cas9 시스템이 M. ruber에서 성공적으로 구축되었음을 검증했다. 본 연구는 M. ruber의 CRISPR/Cas9 시스템에 대한 첫 번째 연구이다.Chapter1 Research background 1 1. Fungi 1 1.1. Filamentous fungi 1 1.2. Monascus spp. 2 1.3. Red yeast rice 2 2. Secondary metabolites 3 2.1. Secondary metabolites in Monascus spp. 3 2.1.1. Monascus pigments 5 2.1.2. Monacolin K 7 2.1.3. Citrinin 9 3. Genome editing 9 3.1. Definition and DNA repair pathway 9 3.1.1. Non-homologous end joining (NHEJ) pathway 10 3.1.2. Homology directed repair (HDR) pathway 10 3.2. CRISPR/Cas9 system 10 3.3. CRISPR/Cas9 system in different species of filamentous fungi 13 4. Overall objectives 15 Chapter 2 Whole genome sequence of Monascus ruber isolated from Korean traditional fermented food 16 1. Introduction 16 2. Materials and methods 18 2.1. Strain and culture conditions 18 2.2. DNA extraction 18 2.3. Genomic sequencing and assembly 19 2.4. Citrinin analysis 19 3. Results and discussion 21 3.1. Genome sequence and assembly 21 3.2. Comparison with other publicly available Monascus genomes 24 3.3. Identification of secondary metabolite gene clusters 26 3.3.1. Monascus pigments biosynthesis 28 3.3.2. Monacolin K biosynthesis 31 3.3.3. Citrinin biosynthesis 33 4. Conclusions 35 Chapter 3 CRISPR/Cas9 system in filamentous fungi Monascus ruber 36 1. Introduction 36 2. Materials and methods 39 2.1. Strains, plasmid, primers, and culture conditions 39 2.2. Preparation of in vitro transcriptional sgRNA 41 2.3. Protoplast preparation and transformation 41 2.4. DNA extraction and PCR analysis of putative M. ruber transformants 42 2.5. Analysis of secondary metabolites 44 2.5.1. Monascus pigment analysis 44 2.5.2. Extraction and analysis of monacolin K 44 2.5.3. Citrinin analysis 45 2.6. RNA extraction and RT-PCR analysis 45 3. Results and discussion 46 3.1. Establishment of Cas9 expressed transformants 46 3.2. Designing dual sgRNA for disrupting MpigI and MpigI' 49 3.3. PCR screening of M. ruber MpigI and MpigI' mutants 49 3.4. Sequencing analysis of MpigI and MpigI' mutants 53 3.5. Comparison of the wild-type M. ruber strain and the mutants of MpigI and MpigI' 61 3.5.1. Fungal growth 61 3.5.2. Colony morphology 61 3.5.3. Monascus pigment production 65 3.5.4. Monacolin K analysis 68 3.5.5. Citrinin analysis with M. purpureus BCRC 31541 68 3.6. RT-PCR analysis of MpigI and MpigI' mutants 71 4. Conclusions 73 References 74 Abstract in Korean 87석

중환자실 환자의 전실스트레스와 극복력과의 관계

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 간호학과, 2014. 2. 김금순.중환자실에 입실하는 환자는 많은 기계장치, 많은 의료진의 집중감시 및 가족과의 분리로 인해 스트레스를 받게 된다. 하지만, 일정기간이 지나 중환자실 환경에 익숙해졌다가 상태호전으로 인해 일반병실로 전실할 때에도 일종의 분리불안 형태인 전실스트레스를 경험하게 된다. 전실스트레스에 대한 반응결과는 환자의 극복력에 따라 다르며, 이에 따른 치료 결과 또한 다양하게 나타난다. 이에 본 연구에서는 중환자 실에서 일반병실로 전실한 환자를 대상으로 전실스트레스 정도와 극복력 정도 및 상관관계를 파악하고자 하였다. 자료수집은 2013년 4월부터 8월까지 S대학교병원 중환자실에서 최소 2일 이상 재원하였으며 일반병실로 전실한지 24 ~ 48시간 이내의 환자 188명을 대상으로 설문 조사하였다. 연구도구는 손연정(2008)의 전실스트레스 측정도구와 Wagnild와 Young(1993)이 개발한 극복력 측정도구를 송양숙(2004)이 수정보완 한 도구를 사용하였다. 수집된 자료는 연구의 목적에 따라 기술통계, t-test, one way ANOVA, 전실스트레스와 극복력의 상관관계는 Pearson Correlation Coefficient로 분석하였다. 본 연구의 주요 결과는 다음과 같다. 1. 대상자의 전실스트레스 정도는 총 115점 만점에 평균 69.59±6.6점, 100점 환산점수 60.5점으로 나타났다. 2. 대상자의 극복력 정도는 총 175점 만점에 평균 86.47±10.0점, 100점 환산 점수 69.2점으로 나타났다. 3. 대상자의 전실스트레스에 유의한 차이를 보인 전실관련 특성은 전실 예고 유무(t=-2.41, p=0.01)로 나타났다. 4. 대상자의 극복력에 유의한 차이를 보인 전실관련 특성은 가족에게 전실 관련 정보 제공 유무(t=1.97, p=0.05)로 나타났다. 5. 중환자실 환자의 전실스트레스와 극복력은 통계적으로 유의한 부적 상관관계 가 있는 것으로 나타났다(r=-.209, p=.004). 이상의 연구 결과, 극복력과 전실스트레스의 상관관계로 볼 때 중환자실 환자의 극복력이 높으면 전실스트레스가 낮을 것을 알 수 있었다. 또한, 환자의 전실스트레스 감소를 위해서는 중환자실 입실 때부터 전실에 대해 미리 정보를 제공하고, 극복력 증진을 위해서는 가족에게 전실할 병동 환경에 대한 설명이 필요하다는 것을 알 수 있었다. 이를 바탕으로 전실 프로토콜 개발과 환자의 가족이 지지자원으로써 역할을 할 수 있도록 가족 교육자료 개발이 필요하겠다.국 문 초 록 ⅰ I. 서 론 1 1. 연구의 필요성 1 2. 연구 목적 3 3. 용어 정의 4 II. 문헌 고찰 5 1. 전실스트레스 5 2. 극복력 10 3. 스트레스와 극복력과의 관계 14 III. 연구 방법 16 1. 연구설계 16 2. 연구대상 16 3. 연구도구 17 4. 자료수집 방법 19 5. 윤리적 고려 20 6. 자료분석 방법 20 Ⅳ. 연구결과 22 Ⅴ. 논의 40 Ⅵ. 결론 및 제언 47 참고 문헌 50 부 록 64 Abstract 74Maste

(The) Time management strategies and the psychological well-being of employed wives

본 연구는 취업주부의 시간관리전략과 심리적 복지감의 실태를 파악하고 시간관리전략과 심리적 복지감의 관계를 분석하고자 한다. 이를 통해 취업주부의 시간갈등을 완화하고 효과적으로 관리할 수 있는 시간관리전략을 모색하고 취업주부의 심리적 복지감을 증진시킬 수 있는 방안을 제공함으로써 취업 주부 가정 전체의 생활의 질을 향상시키는 데 그 목적이 있다. 조사대상은 유의적 표본추출방법에 의해 서울시에 거주하는 자녀가 있는 취업주부 401명을 대상으로 하여 설문지를 통해 자료를 수집한 후 분석하였다. 예비조사와 본조사를 실시하여 얻은 자료를 빈도분석, 백분율, Pearson의 적률상관관계분셕, GLM(General Linear Model), F-test, t-test, Duncan의 다중범위기법, 회귀분석 등의 통계방법에 의해 분석하였다. 주요 연구결과를 요약하면 다음과 같다. 첫째, 취업주부들의 시간관리전략사용수준은 다소 높게 나타났는데, 가장 많이 이용하는 전략은 마감시간지키기 전략이었으며, 활용수준이 가장 낮은 전략은 책임감소 전략으로 나타났다. 시간관리전략과 개인·가정환경적, 직업환경적 변인 및 시간갈등의 관계를 분석한 결과 주부직업지위, 가계소득, 가사조력자, 주부취업시간, 남편의 지지도, 시간갈등이 유의한 변인으로 나타났다. 상대적인 영향력은 시간갈등, 주부직업지위, 남편의 지지도, 가계소득, 주부취업시간, 가사조력자의 순이었으며, 제 변인들의 설명력은 24.9%였다. 즉, 취업주부의 직업지위가 높을수록, 가계소득이 높을수록, 가사조력자가 있는 경우에, 주부의 취업시간이 길수록, 남편의 지지도가 높을수록, 시간갈등이 높을수록 시간관리전략을 많이 사용하는 것으로 나타났다. 이와 같이 시간갈등이 취업주부의 시간관리전략에 대한 영향력이 가장 크게 나타났으므로 이를 완화시키기 위한 시간관리전략의 적극적 활용이 요구된다. 또한 시간관리전략은 직업지위나 소득과 같은 사회경제적 지위와 관련된 변인과 정적인 관계에 있으므로 사회경제적 지위가 낮은 집단에서 효율적으로 사용할 수 있는 시간관리전략의 개발과 교육이 요구된다고 할 수 있다. 둘째, 취업주부의 심리적 복지감은 중상수준으로, 심리적 복지감에 대한, 개인·가정환경적, 직업환경적 변인 및 시간갈등의 영향력을 분석한 결과 주부직업지위, 가계소득, 주부취업시간, 남편의 지지도, 취업동기, 시간갈등이 유의한 변인으로 나타났다. 상대적인 영향력은 남편의 지지도, 시간갈등, 주부직업지위, 가계소득, 주부취업시간, 취업동기의 순이었으며, 제 변인들의 설명력을 31.4%였다. 이상에서 보듯이 취업주부의 심리적 복지감은 사회경제적 지위와 관련된 변인보다 남편의 지지도와 시간갈등에 의해 더 많은 영향을 받고 있음을 알 수 있다. 따라서 취업주부의 남편은 가부장적인 태도를 버리고 의식의 개선과 함께 부인의 취업에 대해 긍정적인 태도를 가지며 합리적인 역할 분담을 통하여 아내의 과중한 노동부담과 시간부족을 덜어주어야 할 것이다. 세째, 취업주부의 시간관리하위전략에 따른 심리적 복지감의 차이를 살펴보면 시간계획 전략, 마감시간지키기전략, 조직화 전략, 지원받기 전략을 많이 사용할수록 취업주부의 심리적 복지감은 높아졌으며, 표준변경 전략을 많이 사용할수록 취업주부의 심리적 복지감은 낮게 나타났다. 따라서 취업주부의 심리적 복지감을 증진시키기 위해서는 주부 스스로가 가사노동을 여성의 일만으로 여기는 전통적 사고방식에서 벗어나 가족원에게 적절한 역할을 배분함으로써 시간의 효율적 사용을 모색하여야 할 것이다. 네째, 취업주부의 심리적 복지감에 대한 제 변인들의 상대적 영향력을 분석한 결과, 취업주부의 직업지위가 높을수록, 가계소득이 높을수록, 남편의 지지도가 높을수록, 시간갈등이 적을수록, 지원받기 전략을 많이 사용할수록, 시간절약재화 및 서어비스이용 전략을 덜 사용할수록, 표준변경 전략을 덜 사용할수록 심리적 복지감이 높아졌다. 또한 제 변인들의 설명력은 40.2%로 나타났으며, 영향력이 가장 큰 변인은 남편의 지지도, 시간갈등, 주부직업지위, 가계소득, 지원받기전략, 표준변경 전략, 시간절약재화 및 서어비스이용 전략의 순이었다. 이와같이 취업주부의 심리적 복지감은 남편의 지지도와 시간갈등에 의해 많은 영향을 받는 것으로 나타났다. 그러나 시간갈등을 완화시켜주는 시간관리전략 중 시간절약재화 및 서어비스이용 전략과 표준변경전략은 심리적 복지감에 부적인 영향을 주는 것으로 나타났는데 이러한 결과는 취업주부가 이들 전략의 사용이 주부로서의 역할을 제대로 수행하지 못하는 것이라고 느끼기 때문으로 해석할 수 있다. 따라서 취업주부는 의식의 개선을 통해 시간을 효율적으로 사용할 수 있는 전략을 활용함으로써 시간갈등을 줄이고 심리적 복지감을 증진시켜야 할 것이다. 이상에서 보듯이, 시간갈등수준이 높아질수록 취업주부의 시간관리전략의 사용은 많아지는 반면에 시간갈등수준이 높아질수록 취업주부의 심리적 복지감은 낮게 나타났다. 또한 취업주부의 시간관리전략 중 지원받기전략은 심리적 복지감에 긍정적 영향을 주는 반면 시간절약재화 및 서어비스 이용전략과 표준변경전략은 취업주부의 심리적 복지감에 부정적 영향을 주고 있다. 이러한 결과는 취업주부의 시간갈등을 완화하고 심리적 복지감을 증진시키는 데 있어 시간관리전략의 적절한 사용이 매우 중요함을 제시해주는 것이라 할 수 있다. 따라서 시간관리전략 중 심리적 복지감에 정적인 영향을 미치는 조직화전략, 지원받기전략을 중심으로 하여 보다 효율적인 전략의 개발이 요구된다. 또한 이는 취업주부 자신의 의식변화와 노력뿐만 아니라 가족원의 의식과 태도 변화를 함께 필요로 하는 것이므로 가족의 협조와 사회적 지원이 아울러 수반되어야 할 것이다. 취업주부는 전통적인 의식에서 탈피하여 합리적인 역할분담을 통하여 시간갈등을 완화해야 할 것이며, 가사노동을 절감하고, 소득으로 대체할 수 있는 전략과 시간을 효과적으로 사용할 수 있도록 하는 시간사용전략을 활용함으로써 심리적 복지감을 증진시켜야 할 것이다.;The purpose of this study was to investigate the relation of time management strategies and psychological well-being of employed wives, to find out the most influential factor on psychological well-being of employed wives. The research issues are as follows: 1. How much are the effects of individual, home-environmental and work-environmental variables and the time conflict on the time management strategies of employed wives? 2. How much are the effects of individual, home-environmental and work-environmental variables and the time conflict on the psychological well-being of employed wives? 3. Are there significant differences in the psychological well-being of employed wives according to the time management strategies ? 4. Mow much are the effects of related variables on the psychological well-being of employed wives? For these issues, theoritical framework was by literature review and applied to an empirical test. The data was collected through the questionaire those respondents were 401 employed wives in Seoul. It was analyzed by various statistical methods such as Frequency, Percentile, GLM F-test, t-test, Duncan's Muttiple Range Test, Pearson's Correlation Analysis, and Multiple Regression Analysis. The results of this research are as follows; 1. The most influential variable on the time management strategies of employed wives was time conflict and the next were wives' occupation, husbands' support, family income, wives' work time, and household work assistant. 2. The most influential variable on the psychological well-being of employed wives was husbands' support and the next were time conflict, wives' occupation, family income, wives' work time reason for work. 3. The psychological well-being of employed wives had significant differences according to the time management strategies such as time planning, keeping deadline, getting support, organizing and changing standards. 4. The most influential variable on the psychological well-being of employed wives was husbands' support and the next were time conflict, wives' occupation, family income, getting support strategy, changing standards strategy and saving time strategy. The results of this study can be attributed to develop the efficient strategy of reducing the time conflict of employed wives and of increasing the psychological well-being of employed wives.목차 = ⅲ 논문개요 = ⅴ Ⅰ. 서론 = 1 A. 문제의 제기 = 1 B. 연구목적 = 4 Ⅱ. 이론적 배경 = 5 A. 취업주부의 생활시간 = 5 B. 취업주부의 시간관리전략 = 11 C. 취업주부의 심리적 복지감 = 19 D. 관련변인의 고찰 = 26 Ⅲ. 연구방법 = 44 A. 연구모형 및 연구문제 = 44 B. 측정도구의 구성 = 45 C. 조사대상 및 자료의 수집 = 50 D. 자료의 분석방법 = 50 Ⅳ. 결과 및 해석 = 52 A. 기초자료의 분석 = 52 B. 연구문제 분석 = 61 Ⅴ. 결론 및 제언 = 77 참고문헌 = 84 부록 = 91 ABSTRACT = 10