효과적인 줄기세포 치료를 위한 막 기반 공배양 플랫폼 개발

학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 공과대학 협동과정 바이오엔지니어링전공, 2017. 8. 김병수.다양한 퇴행성 질환과 장기 손상을 치료하기 위한 줄기세포 치료법에 대한 수요가 증가하고 있다. 체내 이식 전, 줄기세포를 미리 분화시킨 뒤 이식하는 것이 줄기세포 치료의 결과를 향상시킨다는 것으로 보고되어 왔다. 생체 내에서 줄기세포는 주위의 삼차원 미세환경과의 상호작용을 통해 세포 거동 및 기능이 조절된다. 그 동안 줄기세포와 원하는 세포 유형의 공배양은 줄기세포 분화를 유도하는데 효과적인 방법으로 보고되어 왔는데, 다공성 막 기반 공배양 시스템은 막을 통한 세포-세포간 상호작용 및 공배양 후 두 세포 종 간의 용이한 분리를 지원하기에 공배양 플랫폼으로 널리 사용되어왔다. 막 기반 공배양 시스템에서 사용되는 막의 특성은 줄기세포 분화를 유도하는데 중요한 역할을 한다. 막은 공배양 된 타종의 세포 혼합을 막는 물리적 장벽 역할을 하는 동시에, 세포간의 효과적인 상호작용을 허용해야 한다. 불행하게도, 현재 널리 사용되고 있는 막 기반 공배양 시스템은 이러한 요건을 충분히 충족시키지 못한다. 널리 사용되고 있는 막은 두께가 수 마이크로 단위로 두껍고 현저히 낮은 기공도를 가져 공배양된 세포 사이의 상호작용을 제한하여 낮은 줄기세포 분화율을 보인다. 또한, 공배양 후 세포를 채취하는 과정에서 단백질 분해 효소 처리를 수반하게 되어 세포 생존력과 세포외 기질을 손상시킨다. 따라서 이 논문은 효과적인 줄기세포 치료를 위한 막 기반 공배양 플랫폼의 개발을 제시한다. 이 연구의 주요 목표는 다음과 같이 요약된다. 1) 효과적인 줄기세포 분화를 촉진하면서 세포 채취 과정에서 단백질 분화 효소 사용을 피하기 위해 온도 반응성 기능을 가진 나노 두께 및 다공성의 공배양 막 제조. 2) 생체 내 삼차원 세포-세포간 상호작용을 보다 잘 모사하기 위해 생분해성, 나노 두께 및 다공성 막을 개발 및 사용하여 세포 층별 배열을 통한 삼차원 세포 공배양 구조 형성. 또한, 공배양 후 분화된 줄기세포를 간편하게 삼차원 세포-막 구조물로 변환하여 이식 가능성 재현. 3) 키토산 박막을 이용해 줄기세포와 분화된 세포를 다층 공배양 시스템으로 쌓고 분리 가능한 가역적 공배양 플랫폼 시연 및 분화된 줄기세포를 이식하여 조직 재생 효과 검증. 첫째, 우리는 기존의 공배양 막 보다 약 20 배 더 얇고 25 배 이상 기공도가 높은 (nanothin highly porous, NTHP)막을 개발했다. 나노 수준에서 조절되는 NTHP 막의 기공 크기는 공배양 된 세포들 간의 직접적인 접촉을 통한 간극연접 형성에 중요한 요소로 밝혀졌다. 기공 크기가 조절된NTHP 막을 사용한 공배양 시스템에서 줄기세포는 기존의 공배양 시스템에서 보다 향상된 분화율을 보였으며, 이는NTHP 막을 통해 공배양된 세포간 효율적인 생체 활성 분자의 확산 및 효과적인 세포간 물리적 접촉에 의한 것으로 보였다. 또한, NTHP 막의 온도 반응성 기능을 통해 이동-부착 가능하며, 세포외 기질이 보존되어 세포 생존율이 높은 심근 분화된 세포층을 효율적으로 생성했다. 둘째, 우리는 생분해성, 나노 두께 및 높은 다공성의(biodegradable nanothin and highly porous, BNTHP) 막을 사용하여 세포를 층별로 (cellular layer-by-layer, cLbL) 공배양하는 플랫폼을 개발했다. cLbL 공배양 플랫폼은 생체 내 삼차원 미세 환경을 보다 정확히 모사하고, 나노 크기에서 발생하는 다층 세포간 상호작용을 통해 이중층 배양 시스템보다 높은 줄기세포 분화 효율을 보였다. 또한, BNTHP 막은 생분해성, 생체 적합성 및 유연성이 뛰어난 특성을 가지기 때문에, 보다 용이하게 막에 부착된 세포를 삼차원 세포 구조물로 전환 및 이식이 가능하여 세포에 유해한 효소적 수확 방법을 피할 수 있었다. 마지막으로 우리는 공배양된 세포 층 사이에 키토산 박막을 생성하여 가역적으로 세포를 적층하는 플랫폼을 개발했다. 음이온성 말레이미드-콘드로이틴-황산염을 C2C12 근육아세포와 줄기세포 표면 막에 결합하여 세포 독성 없이 세포의 표면 전하를 변형시켰다. 이와 같이 세포막이 변형된 줄기세포 위에 양이온성 키토산 및 C2C12 세포를 순차적으로 첨가하였을 때, 세포 층 사이에 이온 교차결합으로 다공성 키토산 박막이 형성된 이중층 공배양 세포 구조물을 형성할 수 있었다. 세포 층 사이의 키토산 박막은 공배양 세포간 직접적인 상호작용을 지원할 수 있음과 동시에, 미세한 전단응력 처리로 공배양된 세포 층을 쉽게 탈착 시킬 수 있었다. 개발 된 플랫폼을 통해 공배양된 줄기세포는 C2C12 세포와 직접 접촉 이뤄 분화가 촉진 되었고, 이렇게 근육분화된 줄기세포를 근육 손상 모델에 이식하여 뛰어난 근육 재생능을 확인하였다.There is an increasing demand for stem cell therapy to treat various degenerative diseases and impaired organs. Determining the fate of stem cells prior to transplantation has been reported as a strategy to improve the therapeutic outcomes of stem cell therapy. Stem cells are regulated in vivo through interactions with the surrounding microenvironments in three-dimensional (3D) manner. Coculture of stem cells with desired cell types, which recapitulates the complex in vivo cell-cell communications, has been reported as an effective method to direct stem cell differentiation into a specific lineage. The porous membrane-based cocultured system has been widely used to support both cell-cell interactions through the membrane, and easy separation of the cells following coculture. The features of the membrane used for coculturing are crucial to achieve the best outcome. Not only should the membrane act as a physical barrier that prevents the mixing of the cocultured cell populations, it should also allow effective interactions between the cells. Unfortunately, conventional membranes used for coculture do not sufficiently meet these requirements. The micro-thick thickness and the low porosity of the membranes used in conventional coculture systems, facilitate a very limited interaction between cocultured cells, thereby resulting in low efficacy of stem cell differentiation. Furthermore, cell harvesting using proteolytic enzymes following coculture impairs cell viability and the extracellular matrix (ECM) produced by the cultured cells. This dissertation presents the development of membrane-based coculture platforms for effective stem cell therapy. The major goals of this study are summarized as follows: 1) Fabrication of nanothin and highly porous membranes with thermoresponsive functionality to promote efficient stem cell differentiation and avoid enzymatic cell harvesting procedure. 2) Establishment of a coculture system with 3D cellular geometry through cellular layer-by-layer (cLbL) arrangement using biodegradable, nanothin, and highly porous membranes. Such a system mimics the in vivo 3D cell-cell interaction, and readily allows formation of implantable differentiated stem cells-membrane construct following coculture. 3) Demonstration of reversible cell layering platform, mediated by chitosan thin film to layer/delayer stem cells and differentiated cells in coculture, and the therapeutic application of these differentiated cells in tissue regeneration. First, we developed nanothin and highly porous (NTHP) membranes, which are ~ 20-fold thinner and ~ 25-fold more porous than the conventional coculture membranes. The tunable pore size of NTHP membranes at the nanoscale level was found crucial for the formation of direct gap junction-mediated contacts between the cocultured cells. Differentiation of the cocultured stem cells was dramatically enhanced with the pore size-customized NTHP membrane system compared to conventional coculture methods. This was likely due to effective physical contacts between the cocultured cells and the fast diffusion of bioactive molecules across the membrane. Also, the thermoresponsive functionality of the NTHP membranes enabled the efficient generation of homogeneous, ECM-preserved, highly viable, and transfer-printable sheets of cardiomyogenically differentiated cells. Second, we developed a cellular layer-by-layer (cLbL) coculture platform using biodegradable, nanothin, highly porous (BNTHP) membranes. The cLbL coculture platform better mimicked the in vivo 3D microenvironments and facilitated higher extent of cellular cross-talks between cocultured cells, which occurred in nanoscale range, resulting in more efficient stem cell differentiation compared to the conventional bilayer coculture systems. Furthermore, the biodegradable, biocompatible and highly flexible features of BNTHP membranes enabled conversion of the cell-attached membranes into implantable 3D cell constructs, thus avoiding harmful enzymatic harvesting of the cells. Finally, we developed a reversible cell layering platform in coculture mediated by chitosan thin film formed in situ between the cocultured cell layers. Anionic maleimide-chondroitin-sulfate was grafted onto the surface membrane of myogenic C2C12 cells and human mesenchymal stem cells (hMSCs) to modify surface charge of the cells without cytotoxicity. A highly porous chitosan thin film is formed in situ interspacing between the heterogeneous cell layers via ionic crosslinking of cationic chitosan and anionic functionalized-cells, forming compactly assembled double-layered cell constructs. The chitosan film enabled layering of the cells, which allowed active direct interactions between the cell layers, and facile delayering of the cells by a simple treatment of mild shear stress. The developed platform promoted the myogenic commitment of hMSCs via direct contact with C2C12 cells. Delivery of the myogenic committed cells to muscle-injured animal models showed evident muscle regeneration.Chapter 1. Research backgrounds and objectives 1 1.1. Stem cell therapy in tissue engineering and regenerative medicine 2 1.2. Factors influencing the differentiation of native stem cell during in vivo tissue repair 4 1.3. Differentiation of stem cell through coculture 6 1.4. Cell-cell interactions in coculture 8 1.4.1. Indirect interaction through paracrine soluble factors 9 1.4.2. Direct interaction through cell-cell or/and cell-matrix contact 10 1.5. Current coculture systems and their limitations 12 1.6. Research objectives of this dissertation 15 Chapter 2. Experimental procedures 17 2.1. Preparation of membranes/film for coculture 18 2.1.1. Fabrication of NTHP membranes 18 2.1.2. Fabrication of BNTHP membranes 20 2.1.3. Formation of chitosan thin film on cell surface membrane 21 2.2. Characterization of the developed membranes/films 23 2.2.1. Characterization of NTHP membranes 23 2.2.2. Characterization of BNTHP membranes 24 2.2.3. Characterization of chitosan thin films 26 2.3. Cell culture 27 2.3.1. Cell preparation 27 2.3.2. Coculture of MSCs and H9C2 cells with NTHP membranes 28 2.3.3. Coculture of MSCs and chondrocytes with BNTHP membranes 29 2.3.4. Coculture of hMSCs and C2C12 cells with chitosan thin films 31 2.4. Experimental procedures in vitro 33 2.4.1. Cytotoxicity Studies 33 2.4.1.1. Cell viability and proliferation on NTHP membranes 33 2.4.1.2. Cell viability and proliferation on BNTHP membranes 34 2.4.1.3. Cell viability and proliferation upon tris(2-chloroethyl) phosphate (TCEP) reductant treatment and maleimide-conjugated chondroitin sulfate (MCS) engraftment 35 2.4.2. Analyses of cell-cell interactions in various coculture systems 36 2.4.2.1. Cell-cell interaction in coculture using NTHP membranes 36 2.4.2.2. Cell-cell interaction in coculture using BNTHP membranes 38 2.4.2.3. Cell-cell interaction in coculture using chitosan thin films 40 2.4.3. Homogeneity assessment of the collected MSCs post-coculture 41 2.4.4. Generation of transfer-printable cell sheets 42 2.4.5. Quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR) 43 2.4.6. Cell double-labelling with mal-alexa fluor 488 and PKH26 44 2.4.7. ζ-potential analysis 45 2.4.8. Delayering of C2C12 cells following coculture with chitosan thin film 46 2.4.9. Elimination of MCS along with removal of the chitosan thin film 47 2.4.10. Analysis of Paracrine Secretion Profiles 48 2.5. Experimental procedures in vivo 49 2.5.1. Generation and subcutaneous implantation of cells-laden BNTHP membrane 3D constructs 49 2.5.2. Induction of cardiotoxin-induced skeletal muscle injury model and implantation of differentiated cells 50 2.6. Western blot analyses 51 2.7. Histochemical and immunohistochemical staining 52 2.8. Statistical analyses 54 Chapter 3. Development of nanothin coculture membranes with tunable pore architecture and thermoresponsive functionality for generation of transfer-printable stem cell-derived cardiac sheets 55 3.1. Introduction 56 3.2. Results and discussion 59 3.2.1. Fabrication and characterization of NTHP membrane 59 3.2.2. Biocompatibility of NTHP membrane as cell culture substrate 66 3.2.3. Coculture with thermoresponsive NTHP membrane for the generation of transfer-printable cell sheet 68 3.2.4. Varying extents of cellular interactions between cocultured cells depending on the different pore sizes of NTHP membranes 70 3.2.5. Facile, homogeneous collection of MSCs post-coculture 76 3.2.6. Enhanced differentiation of MSCs by NTHP coculture system 79 3.2.7. Generation of transfer-printable, multilayered sheets of differentiated cells 85 Chapter 4. Development of cellular layer-by-layer coculture platform using biodegradable, nanoarchitectured membranes for generation of implantable 3D differentiated cell constructs 89 4.1. Introduction 90 4.2. Results and discussion 93 4.2.1. Fabrication and application of BNTHP membranes in cLbL coculture of stem cells and differentiated cells 93 4.2.2. Physiochemical properties and biodegradation of BNTHP membranes 96 4.2.3. Biocompatibility of BNTHP membranes as cell culture membranes 103 4.2.4. Homogeneous collection of MSCs aided by BNTHP membranes following coculture with chondrocytes 106 4.2.5. Higher intercellular interactions in the cLbL coculture compared to direct bilayer coculture 109 4.2.6. Superior chondrogenic differentiation of MSCs through cLbL coculture 114 4.2.7. Assessment of cartilaginous phenotypes in tissues formed through implantation of the 3D constructs of differentiated cells-laden BNTHP membranes 121 Chapter 5. Development of a reversible cell layering platform in coculture mediated by ionically crosslinked chitosan thin film 127 5.1. Introduction 128 5.2. Results and discussion 132 5.2.1. Synthesis and engraftment of MCS onto reduced cell surface membrane 132 5.2.2. Cytotoxicity of the cell surface membrane modification 135 5.2.3. Formation of porous chitosan thin film for effective cell assembly into heterogeneous coculture constructs 138 5.2.4. Cell delayering of the heterogeneous cell coculture mediated by porous chitosan thin film 142 5.2.5. Enhanced myogenic differentiation of hMSCs after cocultured with C2C12 cells based on reversible cell layering platform 145 5.2.6. Application of the reversible cell layering platform in stem cell-based tissue regeneration 149 Chapter 6. Conclusions 151 References 154 요약 (국문 초록) 177Docto

Cost-effectiveness analysis of vaccination against Herpes Zoster in older adults aged over 60 years in Korea

학위논문 (석사)-- 서울대학교 보건대학원 : 보건학과, 2014. 8. 이태진.1.연구배경 및 목적 국내 대상포진 및 합병증으로 인한 질병부담이 가중되고 있는 가운데, 금기사항이 없는 60세 성인에게 접종이 권장되고 있는 대상포진 백신이 그 유일한 예방책으로 알려져 있다. 대상포진 및 합병증은 심각한 통증으로 인해 중고령자의 삶의 질 저하를 야기시키는 질병이다. 대상포진 백신은 대상포진 및 합병증(신경통) 발생을 감소시키고, 대상포진이 발생하더라도 그 합병증인 신경통 지속기간을 줄여주는 효과가 있다. 대상포진 발생률과 신경통 전이확률은 나이가 많을수록 증가하지만, 대상포진 백신의 예방효과는 고연령일수록 감소하여 연령별 분석이 필요하다. 본 연구에서는 60대 이상의 대상포진 및 합병증의 질병부담을 산출하고, 효과적인 예방 및 질병부담 절감을 위해 대상포진 백신을 국가필수예방접종(NIP) 사업에 포함한다고 가정하여, 보건의료체계 관점에서 백신 접종에 대한 비용-효과 분석을 실시한다. 2.연구방법 60세 이상 노인을 대상으로 대상포진 백신 접종을 하는 대안과 하지 않는 대안을 비교하기 위해 마콥 모형을 이용하여 분석했다. 모형에 포함된 건강상태는 무병, 대상포진, 합병증(신경통), 죽음 등으로 정의했다. 건강보험심사평가원의 전체환자표본을 사용하여 대상포진 및 신경통 유병율, 의료비(입원, 외래, 약제비), 신경통 전이확률 등을 5세 단위로 분석했다. 백신접종 관련비용에는 백신 가격, 백신접종행위료, 접종 시 교통비를 포함하고 질병 발생 시 비용에는 의료비, 교통비, 간병비, 시간비용(60대)을 포함했다. 3.연구결과 환자표본자료 분석 결과, 대상포진 및 합병증은 나이가 많을수록 증가하는 양상을 보였다. 백신 비용은 현재 시장가격의 55%, 백신 접종률 60%, 백신효과 지속기간을 10년으로 가정했을 경우, 60, 65세, 70세, 75세 모두 대상포진 백신을 접종하는 것이 비용-효과적이었다. 그 중 ICER가 18,471.867원/QALY인 65세에 백신을 접종하는 것이 가장 비용-효과적인 대안으로 분석되었다. 4. 결론 대상포진과 신경통이 통증으로 인해 고령 환자의 삶의 질에 큰 영향을 주더라도, 질병 및 합병증의 지속기간이 짧고 직접적인 사망률이 낮아, 가장 비용-효과적인 대안인 65세 대상 백신 접종 시에도 백신 접종의 추가 효과는 0.01QALY로 높지 않았다. 따라서 대상포진 백신의 국가필수예방접종 사업 포함여부를 결정하기 위해서는 경제성 이외에도 여러 요소를 종합적으로 평가해야 할 것이다제 1 장 서 론 1 제 1 절 연구 배경 1 제 2 절 연구 필요성 3 제 3 절 연구 목적 5 제 2 장 선행연구 고찰 6 제 1 절 대상포진 및 합병증 현황 6 (1) 대상포진 및 합병증 발생율 6 (2) 질병부담 9 제 2 절 대상포진 백신의 임상적 효과 13 제 3 절 경제성 평가 16 제 4 절 대상포진 백신의 해외 경제성 분석 18 제 5 절 성인 백신 접종 19 제 3 장 연구 방법 22 제 1 절 분석 모형 22 (1) 비교 대안의 선정 22 (2) 연구 집단 22 (3) 분석 관점 23 (4) 분석 기간 23 (5) 건강 상태 정의 23 (6) 분석 모형 24 제 2 절 모형 투입 요소 26 1. 비용 자료 26 (1) 백신 접종 비용 26 (2) 질병 비용 29 (3) 할인율 37 2. 효과 자료 38 (1) 대상포진 유병률 38 (2) 대상포진 합병증 전이확률 40 (3) 백신의 효과 42 (4) 대상포진 환자의 사망률 44 (5) 대상포진 환자의 삶의 질 44 3. 민감도 분석 47 제 4 장 연구 결과 48 제 1 절 기본 분석 결과 48 (1) 연령별 비용-효과분석 결과 48 (2) WTP 51 제 2 절 민감도 분석 결과 52 (1) 백신 효과 지속기간 52 (2) 백신 접종률 53 (3) 대상포진 예방효과 54 (4) 대상포진 후 신경통 예방효과 54 (5) 백신 접종 가격 55 (6) 할인율 57 (7) 대상포진 발생률 58 (8) 신경통 전이확률 59 (9) 10세군별 분석 61 제 3 절 재정 영향 분석 62 제 5 장 고 찰 64 제 1 절 연구 결론 64 제 2 절 연구의 한계 65 제 3 절 연구의 의의 66 참고문헌 67 Abstract 75Maste