Streptococcus mutans의 biofilm 형성을 억제하는 Lactobacillus paracasei M9-1의 선발 및 평가

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 국제농업기술대학원 국제농업기술학과, 2019. 2. 허철성.충치는 치아 표면에 존재하는 enamel의 demineralization에 의하여 발생한다. 구강 내의 높은 산성도는 enamel 층의 주요 구성 성분인 수산화인회석의 분해를 일으키게 된다. 구강 미생물 중에서도 충치를 유발하는 미생물 들은 구강 내에서 산성도를 높이는 여러 요인 중 하나 이다. 충치 유발 미생물들은 구강 내 잔여 탄수화물을 에너지원으로 사용하고, glucosyltransferase 라는 효소를 이용하여 바이오필름을 형성하며, 유기산들을 생성한다. 건강한 구강 내에서는 일반적으로 인간의 침에 의해 낮은 pH 환경이 중화된다. 그러나 바이오필름이 형성 될 시, 바이오필름은 인간의 침이 바이오필름 내부로 들어오는 것을 방지하고, 내부의 유기산들이 밖으로 방출되는 것을 억제한다. 결과적으로 바이오필름 내부에서는 유기산들이 갇혀 높은 산성 환경이 유지되게 된다. Streptococcus mutans는 glucosyltransferase를 생성하지 못하는 타 미생물에게 glucosyltransferase를 전달하여 해당 미생물 또한 glucan 형성이 가능하게 되어 바이오필름 형성을 가속화시키기 때문에 충치 유발 주요 원인 균으로 잘 알려져 있다. 따라서 본 연구의 목적은 충치의 주요 원인 균인 S. mutans의 바이오필름 형성을 감소시켜 충치 발생을 억제 할 수 있는 유산균 주의 스크리닝 및 평가이다. 본 연구에서는 기존에 타 미생물에 대하여 항균활성 능력이 검증 된 유산균 21 종류를 사용하였다. 안전성 검사를 실시한 결과 EFSA가 제시하는 기준에 21가지 유산균이 모두 부합한 것을 확인하였고, 이는 구강으로 섭취하였을 때, 건강에 이상이 없음을 의미한다. Lactobacillus paracaei M9-1은 실험에 사용된 유산균 중에서 가장 높은 항균 활성 능력을 보였으며 (> 14mm), reference strain인 Lactobacillus rhamnosus GG보다 더 높은 co-aggregation 능력과 가장 높은 biofilm 형성을 억제 능력을 보였다. 따라서 L. paracasei M9-1이 S. mutans의 biofilm 형성을 억제할 수 있는 잠재적인 프로바이오틱스 후보로 선발 되었다. L. paracasei M9-1이 S. mutans의 충치 유발 관련 유전자들에 미치는 영향을 평가해 본 결과, 부착 기능과 관련된 유전자들의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다. 그러므로 본 논문은 L. paracasei M9-1이 항균활성 능력, co-aggregation 능력, S. mutans의 부착 단백질들을 발현하는 유전자들의 발현을 억제하여 S. mutans의 바이오필름 생성을 억제할 수 있기 때문에 충치를 감소시킬 수 있는 프로바이오틱스임을 확인하였다.Dental caries is a disease caused by demineralization of enamel layer in tooth. Acidic condition in oral cavity results in destruction of hydroxyapatite, which is a major component of enamel layer. Cariogenic microorganisms in oral microbiota are one of the reasons that causes acidic condition in oral cavity. They utilize carbohydrates as their energy source and produce organic acids and glucans by using glucosyltransferases to form biofilm. In normal oral cavity, acidic condition is usually neutralized by human saliva. However, when biofilm is formed, it blocks human saliva and keeps organic acids around the enamel layer. As a result, acidic condition is maintained within biofilm. Streptococcus mutans is well known for acceleration of biofilm formation by providing glucosyltransferases (Gtfs) to other microbiota which cant produce Gtfs, thereby accelerating biofilm formation. The aim of this study is to screen and evaluate lactic acid bacteria (LAB) which has inhibitory effects against biofilm formation of S. mutans. 21 LAB, which have been proven for their antimicrobial activity against pathogenic bacteria in previous study were used in this study, The results of safety assessment showed all of tested LAB satisfied criteria from EFSA, which suggests that all of tested LAB are safe when consumed by mouth. Lactobacillus paracasei M9-1 showed highest antimicrobial activity (> 14mm), higher co-aggregation ability than that of reference strain, Lactobacillus rhamnosus GG and highest inhibition ability in biofilm formation against S. mutans among tested LAB. Therefore, L. paracasei M9-1 was selected as a promising probiotic strain which has inhibitory effects against biofilm formation of S. mutans. The effects of L. paracasei M9-1 on the caries-inducing related gene expression in S. mutans caused the reduction of adhesion related gene expression. In conclusion, L. paracasei M9-1 is the promising probiotic strain which can reduce dental caries by their antimicrobial ability to reduce cell concentration of S. mutans, co-aggregation ability to prevent S. mutans from binding to tooth surface, and inhibition ability to reduce adhesion related gene expression of S. mutans, thereby reducing biofilm formation of S. mutans.Abstract i Contents iv List of Tables viii List of Figures ix List of Abbreviations xii Chapter 1. Introduction 1 Chapter 2. Review of Literature 3 2.1. Dental caries in oral cavity 3 2.1.1. Dental caries 3 2.1.2. Demineralization of hydroxyapatite 7 2.1.3. Acidic condition is maintained by cariogenic oral microbiota 10 2.1.4. Streptococcus mutans 14 2.2. The caries-inducing factors of S. mutans 15 2.2.1. Biofilm formation 15 2.2.2. Acid tolerance response 22 2.2.3. Adhesion factors 24 2.3. Probiotics and their anti-cariogenic role 26 2.3.1. Probiotics 26 2.3.2. Benefical effects of probiotics in oral cavity 27 2.3.3. Potential cariogenicity of probiotics 30 Chapter 3. Materials and Methods 31 3.1. Screening of potential probiotics with inhibition ability against biofilm formation by S. mutans 31 3.1.1. Bacterial strains and growth condition 31 3.1.2. Preparation of culture supernatant 33 3.1.3. Safety assessment 33 3.1.4. Antimicrobial activity test 37 3.1.5. Co-aggregation assay 37 3.1.6. Biofilm inhibition assay by LAB against S. mutans 38 3.1.7. Carbohydrate fermentative pattern and enzymatic profiling 41 3.2. Potential cariogenic ability of selected probiotic strains 41 3.2.1. Biofilm formation of the selected probitoic strains 41 3.2.2. The hydroxyapatite degradation 42 3.3. Inhibitory effects of selected probiotic strains on the gene expression in S. mutans 42 3.3.1. Extraction of total RNA 42 3.3.2. Quantitative real-time polyermerase chain reaction (qRT-PCR) and data analysis 44 Chapter 4. Results 48 4.1. Screening of potential probiotics with inhibition ability against biofilm formation by S. mutans 48 4.1.1. Safety assessment 48 4.1.2. Antimicrobial activitiy 52 4.1.3. Co-aggregation ability with S. mutans 54 4.1.4. Biofilm inhibition ability against S. mutans 56 4.1.5. Selection of potential probiotics 60 4.1.6. Carbohydrate fermentative pattern and enzymatic profiling 60 4.2. Potential cariogenic ability of selected probiotic strains 62 4.2.1. Biofilm formation of selected probiotic strains 62 4.2.2. Degradation of hydroxyapatite 64 4.3. Inhibitory effects of probiotic strains on the gene expressions in S. mutans 67 4.3.1. Alteration in biofilm formation associated gene expression 67 4.3.2. Alteration in acid tolerance associated gene expression 74 4.3.3. Alteration in adhesion associated gene expression 78 Chapter 5. Discussion 82 References 99 Abstract in Korean 121 List of Tables Table 1. The summary of probiotics and their actions in oral cavity 29 Table 2. List of bacterial strains used in this study 32 Table 3. Composition (%) of decarboxylase medium 34 Table 4. List of primers used in this study 46 Table 5. Minimum inhibitory concentration (ug/ml) of antibiotics to LAB 49 Table 6. The antimicrobial activity of LAB against S. mutans ATCC25175 53 List of Figures Figure 1. The global prevalence of dental caries in 12 years- old children 4 Figure 2. Structure of normal tooth 6 Figure 3. The demineralization of tooth under low pH condition 9 Figure 4. The biofilm formation by cariogenic oral microbiota 13 Figure 5. Synthesis of water-insoluble glucan by glucosyltransferase B in S. mutans 16 Figure 6. Model of glucan-mediated bacterial adherence 18 Figure 7. Schematic representation of two component signal transduction system VicKR 21 Figure 8. Competence stimulating peptide and role of comCDE system 23 Figure 9. Proposed role of acid tolerance system in S. mutans 23 Figure 10. The role of srtA in Gram-positive bacteria 25 Figure 11. The schematic diagram of safety assessment 36 Figure 12. Time schedule for the (a) prevention and (b) inhibition assays of biofilm formation by S. mutans 40 Figure 13. Co-aggregation ability of LAB with S. mutans (a) ATCC 25175, and (b) ATCC700610 55 Figure 14. Inhibitory effects of LAB on biofilm-forming S. mutans (a) ATCC25175, and (b) ATCC700610 58 Figure 15. Inhibitory effects of LAB on preformed biofilm of S. mutans (a) ATCC25175, and (b) ATCC700610 59 Figure 16. Heatmap of carbohydrates fermentative pattern and enzymatic profiling of selected probiotic strains and S. mutans strains 61 Figure 17. Biofilm formation ability of selected probiotic strains 63 Figure 18. The calcium releasing ability of S. mutans and selected probiotic strains 66 Figure 19. Effects of probiotics on expression of biofilm- associated genes in biofilm-forming S. mutans 69 Figure 20. Effects of probiotics on expression of sacB, vicK, and vicR genes in biofilm-forming S. mutans (a) ATCC25175, and (b) ATCC700610 70 Figure 21. Effects of probiotics on expression of biofilm- associated genes in planktonic S. mutans 72 Figure 22. Effects of probiotics on expression of sacB, vicK, and vicR genes in planktonic S. mutans (a) ATCC 25175, and (b) ATCC700610 73 Figure 23. Effects of probiotics on expression of acid tolerance genes in biofilm-forming S. mutans (a) ATCC 25175, and (b) ATCC700610 75 Figure 24. Effects of probiotics on expression of acid tolerance genes in planktonic S. mutans (a) ATCC 25175, and (b) ATCC700610 77 Figure 25. Effects of probiotics on expression of adhesion genes in biofilm-forming S. mutans (a) ATCC 25175, and (b) ATCC700610 79 Figure 26. Effects of probiotics on expression of adhesion genes in planktonic S. mutans (a) ATCC 25175, and (b) ATCC700610 81Maste

상호교섭적 감정 어휘 의미 조정 경험을 통한 사회 감정 문식성 향상 방안 연구

본 연구는 감정 어휘로 부호화된 감정과 해독된 감정 사이의 의미 격차가 공 감적 대화를 저해하고 삶의 여러 국면에 부정적 영향을 미친다는 문제의식을 바 탕으로 사회•감정 문식성 향상을 위한 교수•학습의 방법적 원리 제안하였다. 이를 위해 본고는 국어과 감정 교육의 목표로 사회•감정 문식성을 개념화하고, 그것을 발화 공동체의 사회•문화적 감정 규범에 기반을 두고, 자신과 타인의 감정을 인식하고, 자신의 감정을 적절하게 부호화하고, 타인의 감정을 공감적으로 해독할 수 있는 의사소통 능력으로 정의하였다. 그리고 사회•감정 문식성의 내용 범주를 자기-타인 차원과 인식-의사소통 차원이 교차하는 자기 감정 인식, 타인 감정 인식，자기 감정 부호화，타인 감정 해독의 4개 범주로 구축하였다. 교수•학습의 원리는 감정 의사소통 차원의 선행 단계로서 감정 인식 차원의 자기 감정 인식과 타인 감정 인식에 초점을 맞추어 상호 교섭적 의미 조정 경험을 제공하는 3개 단계로 구안하였다. 1단계는 자기 감정 인식의 단계로 감정 어휘의 극성-각성을 측정하는 단계이고，2단계는 타인 감정 인식 단계로, 1단계에서 수행한 감정 어휘 측정 결과를 학습자들이 서로 공유하는 단계이다. 마지 막 3단계는 자기 감정 재인식 단계로, 핵심 발화 공동체인 학급 구성원 간의 감 정 어휘의 의미 규범을 토론을 통해 형성하는 단계이다. This study proposes a teaching-learning process to improve social-emotional literacy based on the problem that differences in meaning between emotions encoded and decoded by emotional vocabulary interfere with empathic communication and negatively affect various aspects of life. This article conceptualizes social and emotional literacy as the ability to recognize and communicate emotions in ourselves and in others, to encode our emotions appropriately, and to decode others emotions empathically, based on the social and cultural emotional norms of the speech community. Social and emotional literacy uses four content categories: interpersonal emotional awareness, intrapersonal emotional awareness, interpersonal emotional communication, and intrapersonal emotional communication. The article proposes a three-step teaching-learning process to provide a transactional meaning-coordination experience, focusing on the awareness phase that precedes the communication phase in social and emotional literacy: (1) awareness of our own emotions, (2) awareness of emotions in others, and (3) having a new awareness of our own emotion

수형도와 주차 함수의 개수에 대한 세분화

학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 수리과학과, 2007. 8, [ v, 42 p. ]A $\emph{leader}$ of a tree $T$ is a vertex which has no smaller descendants in $T$. Gessel and Seo showed that $\displaystyle\sum_{T \in T_n}u^{(\# of leaders in T)}c^{(degree of 1 in T)} = u P_{n-1}(1,u,cu),$ which is a generalization of Cayley``s formula, where $T_n$ is the set of trees on $[n]$ and $P_n(a,b,c) = c \displaystyle\prod_{i=1}^{n-1}(ia+(n-i)b+c).$ Using a variation of the Pr$\ddot{u}$fer code which is called an \em{RP-code}, we give a simple bijective proof of Gessel and Seo``s formula. A car in a parking function is called $\emph{lucky}$ if it succeeds to park in its preferred space. Gessel and Seo also showed that $\displaystyle\sum_{P \in PF_n} u^{(\# of lucky cars in P)} = P_n(1,u,u),$ but this proof was not combinatorial. We construct the bijection $\varphi$ from forests to parking functions and give a bijective proof of it. We generalize it further using the bijection $\varphi$.한국과학기술원 : 수리과학과