Effects of laminar shear stress on the glycocalyx layer turnover in endothelial cell after enzymatic disruption

Endothelial glycocalyx layer (EGL) plays an important role in mechanoreceptor. Previous studies have demonstrated that the thickness of EGL is relatively thin in the region subjected to athero-prone flow condition in vivo. In this research, the effects of laminar shear stress on the EGL turnover have been studied in vitro to suggest that self-renewal of the EGL is a significant aspect of the protective nature for arterial endothelium. We have measured the loss of heparan sulfate, the most abundant component in EGL, from bovine aortic endothelial cells following heparinase III (HepIII) treatment. After this enzymatic disruption, the reconstitution of the heparan sulfate has been investigated by means of quantitative immunofluorescence imaging method under 15dynes/cm2 laminar shear stress conditions. Even though EGL-removed cells are under no-flow condition, endothelial cells start to reconstitute EGL itself. Surprisingly, EGL turnover is enhanced by fluid shear stress in injured cells as well as intact cells. After HepIII injury, EGL is fully recovered after 10 hours of shear stress, and reached the same amount of EGL of intact cells after 24 hour of shear stress. We also have observed that EGL is actively remodeled in the cell boundary under shear stress conditions. The present experiments demonstrate that removal of a severe fraction of the heparan sulfate with HepIII can be reversible. It means that re-growth of EGL allows the endothelial cells to respond again to fluid flow and aligning in the direction of flow, and inhibition of proliferation

미세유동 플랫폼에서 모사한 기계적 환경에 따른 세포의 구조 및 기능 변화

학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 기계공학전공, 2013.2 ,[xi, 85 p. :]세포 운동은 신생혈관형성, 배아발생, 조직재생, 암세포의 전이 등 생리학적, 병리학적으로 필수적인 현상이다. 다양한 생화학적 요소뿐만 아니라 기계적인 환경에 의해서도 이런 세포의 운동 현상이 조절될 수 있다. 본 연구에서는 상처치유와 신생혈관형성 과정에서 세포 주변에 형성되는 기계적인 환경에 의해 나타나는 세포의 방향성 있는 움직임에 대해 연구했다. 피부에 상처가 발생하면, 조직 내부의 세포는 혈장액 유출에 의한 유동전단응력과 함께 전하 이동에 의한 상대적인 전기장을 내재적으로 겪게 된다. 조직의 세포외기질을 재형성하는 역할을 하는 섬유아세포는 이런 방향성 있는 물리적 환경에 의해 상처 쪽으로 이동하여 상처 치유에 결정적인 역할을 한다고 알려져 있다. 하지만 상처가 발생하면 이런 물리적 환경은 독립적으로 나타나는 것이 아니라 동시다발적으로 일어난다. 그러므로 본 연구는 유동전단응력과 전기장이 동시에 작용될 때 나타나는 섬유아세포의 상승적 운동현상을 관찰하고자 한다. 이를 위해 유동전단응력과 전기장을 독립적으로 제어하면서 동시에 또는 순차적으로 가할 수 있는 미세유동채널을 연성식각공정을 통해 개발했다. 본 장비를 이용한 개별적인 자극 실험에서 인간 정상 진피 섬유아세포는 최대 $20 dyne/cm^{2}$ 까지 전단응력이 증가함에 따라 유동 방향으로 이동하는 경향이 커지며, 마찬가지로 최대 2 V/cm 까지 전기장이 증가함에 따라 높은 전위인 양극으로 이동하는 경향이 증가했다. 세포가 방향성 있는 움직임을 만들기 위해서는 분극화 과정을 겪게 되는데 이 과정에서 세포내골격과 함께 세포 자체의 모양이 유동방향에 수평하게, 반대로 전기장에 수직하게 재정렬되었으며, 세포는 이렇게 재정렬된 세포 모양에 의해 움직이는 방향에 제한을 받았다. 실제 피부 상처의 상황을 모사하여 $10 dyne/cm^{2}$ 의 유동전단응력과 함께 1 V/cm 의 전기장을 동시에 가했을 때 세포는 자극의 방향으로 순간적인 속도의 증가를 보였으며, 그에 따라 더 멀리 이동할 수 있었다. 즉 상처 주변에서 내재적으로 발생하는 복합적인 물리적 환경은, 조직을 재형성하는 섬유아세포로 하여금 더 효과적으로 상처로 이동함으로써 초기 상처치유 과정에 도움을 줄 수 있다는 것을 의미한다. 한가지 흥미로운 현상은 전단응력과 전기장의 두 가지 서로 다른 물리적 자극을 반대로 가했을 때에는 방향성을 잃고 무작위로 이동하게 되는 자극의 쌍들이 존재함을 확인했다. 외부에서 작용하는 두 가지 힘이 세포 내부로 전달되는 기전과 신호전달체계에 대해 연구할 수 있는 중요한 관찰이며, 향후 자극의 유무를 감지하는 표면자극 수용체 연구에 활용될 수 있을 것이다. 혈관은 혈액의 유동에 의해 끊임없이 유동전단응력을 받고 있으며, 혈관 내벽을 감싸고 있으면서 혈액과 조직을 분리하는 역할을 하는 혈관내피세포는 이런 전단응력의 크기와 파형에 따라 민감하게 반응한다고 알려져 있다. 본 연구에서는 혈관내피세포에 작용하는 전단응력이 새로운 혈관형성에 미치는 영향을 파악하고자 했다. 이를 위해서 신생혈관형성에 가장 중요한 생화학적 조절자로 알려진 혈관형성인자의 농도구배를 형성하면서 균일한 전단응력을 가할 수 있는 미세유동채널을 개발했다. 이렇게 개발된 장비는 채널 내부에 구성된 3차원 세포외기질을 침투하면서 일어나는 신생혈관형성의 과정을 실시간으로 관찰할 수 있는 장점이 있다. 먼저 유동이 없는 환경에서 탯줄 정맥 혈관내피세포는 혈관형성인자의 농도구배를 거슬러 3차원 세포외기질을 침투하며, 안지오포이에틴-1 (Angiopoietin-1)과 인간 정상 진피 섬유아세포의 공동배양을 통해 안정적인 혈관내강이 형성되는 것을 확인했다. 일반적인 정맥의 생리학적 전단응력 범위인 $3 dyne/cm^{2}$ 의 일정한 유동전단응력을 혈관내피세포 표면에 가하면 혈관형성인자의 유무와 관계없이 3차원 기질을 침투하는 정도가 크게 증가하는 것을 관찰했으나, 세포가 결합 없이 단독으로 분리되어 이동하는 세포가 주로 나타나는 것을 확인했다. 전단응력에 의한 혈관형성을 안정화시킬 생화학적 요소에 대해 추가적인 실험을 진행하고 있으며, 전단응력을 감지하는 혈관내피세포의 표면자극 수용체의 역할에 대해 추가로 연구할 예정이다.한국과학기술원 :기계공학전공

상처치유의 상승작용을 유도하는 유동전단응력과 전기장의 복합자극

In injured tissues, interstitial flow and endogenous electric field are naturally generated to enhance healing process. These physical stimulations are known to play a vital role in wound healing process such as migration and ECM (extracellular matrix) production. To examine the combinatorial effects of fluid shear stress and electric field on the migration of fibroblast, an integrated microfluidic platform with an agar salt bridge was developed using soft lithography. Our preliminary results showed that two directional cues, mimicking the wounded situation, induce directional migration of fibroblasts to yield positive effects on healing of the wounds. Further researches are in progress to understand the synergetic effects of shear stress and electric fields in regard to the translocation of membrane receptors and ECM protein synthesi

Chematoxis Analysis Microfluidic Apparatus of bacteria, Production Method and Chematoxis Analysis Method of bacteria

박테리아의 주화성 분석용 마이크로 플루이딕 장치, 제조방법 및 이를 이용한 박테리아의 주화성 분석 방법을 개시한다. 상기 박테리아의 주화성 분석용 마이크로 플루이딕 장치는 외부로부터 제공되는 유리 하부기판; 상기 유리 하부기판 상에 접하되도록 형성되는 PDMS 상부 기판;을 포함하며, 상부 기판은, 다종의 세포를 배양시키는 적어도 하나 이상의 세포 배양 챔버; 상기 PDMS 상부 기판 내에 형성되며, 외부로부터 제공되는 박테리아를 상기 상부 기판 내에 주입시키도록 형성된 박테리아 주입구; 외부로부터 제공되는 콜라겐 젤이 주입되는 적어도 한 개 이상의 콜라겐 젤 주입구;를 포함하며, 상기 PDMS 상부 기판은, 상기 세포 배양 챔버, 박테리아 주입 채널 입구, 박테리아 추출 채널 출구 및 콜라겐 젤 주입구가 연결시키는 미세 유로들가 형성되는 것을 특징으로 한다

Microfluidic cell culture device equipped with multi-physical stimulations of electrical field, shear stress and substrate rigidity

본 발명은 세포가 받고 있는 전단응력과 전기장을 독립적으로 제어하면서 다양한 외부 자극에 의한 세포의 반응을 실시간으로 관찰할 수 있는 미세유체 세포배양장치에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 균일한 전단응력을 가하기 위해 채널의 높이가 낮고 폭이 넓은 형태의 직사각형 단면을 가지는 세포 배양부, 상기 세포 배양부의 양단에 삽입되는 한천 염다리부(agar salt bridge), 실리콘 계열의 고분자 화합물로 덮은 후 경화시켜 유동액의 누수가 없도록 구성되어 채널 내부의 바닥에 삽입되는 전압 프로브(voltage probe)를 포함하고, 상기 실리콘 계열의 고분자 화합물이 전압 프로브의 피복의 역할과 동시에 세포가 자라는 기질(substrate)의 역할을 하며, 실리콘을 형성하는 조건을 변경하여 재질의 강성(rigidity)을 조절함으로써 세포가 자라는 생체 내 환경 또는 질병 상태를 모사할 수 있도록 구성된 전단응력과 전기장 및 바닥의 강성조절이 가능한 미세유체 세포배양장치가 제공된다