광 활성 나노소재를 이용한 이광자 및 광음향 시스템

DoctorA variety of nanomaterials have been widely investigated for photonic applications including organic dyes, carbon materials, polymeric nanoparticles, 2D nanomaterials, iron oxide nanoparticels (IONPs), gold nanoparticles (AuNPs), silica nanoparticles (SiNPs) and upconversion nanoparticles (UCNPs). With the unique physical, chemical and optical properties, photonic nanomaterials generate fluorescence, surface plasmon resonance and heat upon absorbing the light. The optical properties of photonic nanomaterials can be tuned easily by changing their particle size and shape due to the quantum confinement effect. During my PhD research, several photonic nanomaterials have been developed for two-photon and photoacoustic (PA) applications including diagnosis, therapy and theranosis. In part I, hyaluronic acid (HA) derivatives were developed for two-photon and PA applications as a target specific delivery carrier to cornea, colon and liver tissues. HA is known to be the component of vitreous humor, skin and extracellular matrix (ECM). HA can bind to HA receptors such as cluster determinant 44 (CD44) and lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE-1). First, after labeling with a hydrophilic red fluorescence dye of HiLyte 647, two-photon fluorescence microscopy was carried out to visualize topically administered Flt1 peptide-HA conjugate micelles encapsulating a hydrophobic green dye of 5(6)-carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester (CFSE) as a model drug. In vivo two-photon microscopy revealed that Flt1 peptide – HA conjugate micelles were absorbed and remained on the corneal epithelia with an increased residence time, facilitating the corneal delivery of CFSE. Furthermore, repeated eye drops of Flt1 peptide - HA conjugate micelles showed comparable therapeutic effect to the subconjunctival injection therapy on the corneal neovascularization. From the results, we could confirm the feasibility of Flt1 peptide – HA conjugate micelles for eye drop treatment of corneal neovascularization. Second, we developed HA – peanut agglutinin (PNA) conjugates for the bioimaging of colon cancer. The HA-PNA conjugates were successfully synthesized by the coupling reaction between aldehyde-modified HA and the N-terminal amine group of PNA. Then, rhodamine B (RhoB) was chemically conjugated onto PNA in HA-PNA conjugates. After intraluminal injection of HA-PNA-RhoB conjugates into tumor-bearing mice, small-sized colon cancers could be effectively visualized by ex vivo imaging with an in vivo imaging system (IVIS) and a two-photon microscope. With these results together, we could confirm the feasibility of HA-PNA-RhoB conjugates as a bioimaging agent for detecting colon cancers. Third, HA – silica nanoparticle (SiNP) conjugates were successfully developed for the bioimaging of liver tissues. The HA-SiNP conjugates were prepared by amide bond formation between diaminohexane (DAH) modified HA and the carboxyl group of SiNP. After intravenous injection of HA-SiNP conjugates into mice, liver tissues could be effectively visualized by in vivo/ex vivo PA imaging. The results confirmed the promising potential of HA-SiNP conjugates as a bioimaging agent to visualize liver tissues. In Part II, carbon dot – chlorin e6 – HA (Cdot-Ce6-HA) conjugate was developed for diagnostic and therapeutic applications. Ce6 has two different effects: generation of radical species with laser irradiation and scavenging of radical species without laser irradiation. Thus, Cdot-Ce6-HA conjugate can be applied as a photodynamic therapy (PDT) agent and a radical scavenging material depending on the treatment of light. First, we investigated a facile transdermal PDT of melanoma skin cancer using Cdot-Ce6-HA conjugates. The Cdot-Ce6-HA conjugate was synthesized by the coupling reaction of diaminohexane modified HA (DAH-HA) with the carboxylic group of Ce6. The singlet oxygen generation of Cdot-Ce6-HA conjugates in aqueous solution was more significant than that of free Ce6. The enhanced transdermal and intracellular delivery of Cdot-Ce6-HA conjugates to B16F10 melanoma cells in tumor model mice were visualized by confocal microscopy and two-photon microscopy. The laser irradiation after topical treatment with Cdot-Ce6-HA conjugates resulted in complete suppression of melanoma skin cancers. The antitumor effect was confirmed by histological analysis with H&E staining and TUNEL assay for tumor apoptosis. Taken together, we could confirm the feasibility of Cdot-Ce6-HA conjugate for transdermal PDT of melanoma skin cancers. Second, we investigated a facile anti-oxidant therapy of retinitis pigmentosa (RP) using Cdot-Ce6-HA conjugates. The radical scavenging effect of Cdot-Ce6-HA was more significant than that of free Ce6 or Cdot-Ce6. The enhanced intracellular delivery of Cdot-Ce6-HA conjugates to ARPE-19 retinal epithelial cells in sodium iodate model was visualized by confocal microscopy. The treatment of Cdot-Ce6-HA conjugates resulted in prevention of retinal degeneration from the oxidative stress. The radical scavenging effect was confirmed by histological analysis with H&E staining and TUNEL assay for the prevention of retinal degeneration. Furthermore, we could confirm the potential of Cdot-Ce6-HA conjugates for the treatment of RP by scavenging the oxygen radicals. In part III, we synthesized biocompatible and near-infrared (NIR) light absorbing N-doped Cdot (N-Cdots) for PA imaging and photothermal therapy (PTT) by carbonizing organic acids with a nitrogen source. The synthesized N-Cdots showed excellent photostability and strong optical absorbance in the NIR region, where tissue and hemoglobin show small optical absorbance. N-Cdots showed high PA signals enough to visualize the inside of live animals and enabled minimally invasive PTT. We performed time-resolved PA imaging of sentinel lymph nodes (SLNs) and assessed the renal clearance after hypodermic injection to investigate the biodegradability and potential application of N-Cdots as a PA imaging contrast agent. The degradation and cytotoxicity tests verified the biodegradability of N-Cdots. Finally, we could effectively treat the skin cancer by the photothermal ablation of N-Cdots after intratumoral injection. The light-absorbing material of N-Cdots might be developed further as a promising agent to enhance the optical contrast in PA imaging and the effect of PTT for the treatment of cancer. All these results of my research for PhD thesis might contribute greatly to the development of photonic nanomaterials for theranostic applications.유기광학소재, 탄소 소재, 고분자 나노입자, 2차원 나노소재, 산화철 나노입자, 금 나노입자, 실리카 나노입자, 상향변환 나노입자 등과 같은 다양한 나노소재를 이용한 광학적 응용에 대해 많은 연구가 진행되고 있다. 광 활성 나노소재는 독특한 물리적, 화학적, 광학적 성질을 가지기 때문에 빛을 흡수하게 되면 형광, 플라즈몬, 열 등을 발생시킨다. 이러한 광 활성 나노소재의 광학적 성질은 나노입자의 크기와 모양을 변화시킴으로써 조절할 수 있다. 본 박사 학위 과정에서는 여러 가지 광 활성 나노소재를 개발하여 이광자 및 광음향 이미징 기술을 통해 의료영상 및 치료에 적용하는 연구를 수행하였다. 파트1에서는 히알루론산 유도체를 합성한 후 각막, 대장, 간 조직 표적 지향 전달 특성을 이광자 및 광음향 이미징을 통해 분석하는 연구를 수행하였다. 히알루론산은 유리 초자체, 피부, 세포외 기질 등을 이루는 구성 요소이다. 히알루론산은 CD44나 LYVE-1과 같은 히알루론산 수용체에 결합할 수 있다. 파트1 첫 번째 연구는 신생혈관 억제 펩타이드인 Flt1 펩타이드를 히알루론산에 접합시켜 안구 내에서의 동향을 이광자 현미경을 통하여 확인하고 이를 점안 형태로 각막신생혈관 치료에 응용한 연구이다. 마이셀과 같은 나노입자 구조를 가지는 Flt1 펩타이드-히알루론산 접합체를 각각의 유기염색물질로 염색한 뒤 각막에서의 머무는 시간 및 투과 깊이를 이광자 현미경을 통하여 분석하였다. 동물 모델에서의 표적 지향 전달 특성을 검증하였고 이를 바탕으로 반복된 점안 방법이 한번의 안구 주사에 비해 각막 신생혈관 치료 효과가 있는 것을 검증하였다. 이러한 결과로부터 Flt1 펩타이드-히알루론산 접합체 마이셀은 점안 방법으로 각막 신생혈관 치료 효과가 있는 것을 확인 할 수 있었다. 파트1의 두 번째 연구는 대장암 표적지향 단백질인 땅콩단백질을 히알루론산에 접합시켜 땅콩단백질-히알루론산 접합체를 합성하였고 이를 이광자 현미경을 통하여 대장암에 표적 지향되는지를 확인하였다. 접합체의 물질안정성을 확인하였으며 세포 수준에서의 대장암 세포 표적 지향 전달 특성을 분석 한 후, 동물 수준에서의 대장암 표적 지향 특성을 대장암 동물 모델에 항문을 통해 땅콩단백질-히알루론산 접합체를 주입한 뒤 장을 적출하여 생체이미징 시스템 및 이광자 현미경을 통해 확인하였다. 이러한 결과들을 바탕으로 땅콩단백질이 접합된 히알루론산은 대장암 검출을 위한 생체이미징에 쓰일 수 있는 조영재로서의 가능성을 확인하였다. 파트1의 세 번째 연구는 실리카 나노입자에 히알루론산을 접합시켜 간 조직 이미징 물질로서 응용하였다. 히알루론산-실리카 나노입자 접합체는 다이아미노헥산이 접합된 히알루론산 접합체의 아민그룹과 실리카 나노입자의 카복실 그룹간의 아마이드 그룹 형성 과정을 통해 합성 되었다. 히알루론산-실리카 나노입자 접합체를 정맥 주사한 후 광음향 이미징을 통해 간 조직이 이미징 되는지를 확인하였다. 이러한 결과들을 바탕으로 히알루론산-실리카 나노입자 접합체는 간 조직을 영상화 하기위한 생체이미징 조영재로서의 가능성을 확인하였다. 파트2에서는 탄소나노입자-광감응제-히알루론산 접합체를 합성하여 빛의 조사유무에 따라 피부암 치료를 위한 광 동력학 치료 시스템 및 망막색소 변성증 치료를 위한 활성산소 억제 시스템으로 개발하기 위한 연구를 수행하였다. 빛에 반응하여 암 주변 산소를 삼중항에서 일중항으로 변환시켜 암세포의 자가괴사를 일으키는 광감응제를 물에 녹게 하기 위해 탄소나노입자를 접합시켰으며 경피 전달 또는 안구 망막 전달을 위해 히알루론산을 접합시켰다. 파트2의 첫 번째 연구는 피부암 치료를 위해 빛을 이용한 광동력학 경피전달 시스템 개발이다. 일중항 산소 발생 효율이 광감응제 단독 물질에 비해 높은 것을 확인하였다. 공초점 현미경과 이광자 현미경을 통하여 탄소나노입자-광감응제-히알루론산 접합체가 세포 내 섭취 및 경피 전달 효율이 높아진 것을 이미징 하였다. 또한 피부암이 생긴 동물모델을 이용하여 피부암 세포 위의 피부에 물질을 바른 뒤 레이저를 조사한 경우 암이 완벽히 제거 되는 것을 확인하였다. 이러한 결과들을 바탕으로 탄소나노입자-광감응제-히알루론산 접합체는 멜라노마 피부암 치료를 위한 경피전달 광동력학 치료제로서의 가능성을 확인하였다. 파트2의 두 번째 연구는 활성산소에 의한 망막 표피 세포의 퇴화를 막기 위해 활성산소를 억제해주는 물질로서 탄소나노입자-광감응제-히알루론산 접합체를 연구하였다. 광감응제는 빛이 없는 환경에서는 활성산소를 만들어주는 광동력학 메커니즘 보다는 활성산소를 억제하는 활성산소 억제 메커니즘이 작용하는 것으로 연구되고 있다. 이를 망막 세포를 이용한 세포 수준에서 표적 지향 되는지, 실제 활성산소 억제 효율이 있는지를 확인하였으며 랫을 이용한 동물 수준에서는 실제 망막세포가 퇴화되는 것을 막아주는지를 조직 검사를 통하여 확인하였다. 그 결과 탄소나노입자-광감응제-히알루론산 유도체를 망막색소 변성증 치료를 위한 활성산소 억제 치료제의 가능성을 확인하였다. 파트3에서는 UV 영역대에서 빛이 나오는 것으로 알려진 탄소나노입자를 질소 도핑을 이용하여 근적외선 영역에서 빛을 흡수하도록 만들었으며 형광 보다는 열을 발생시키도록 합성하였다. 근적외선 영역에서는 조직이나 헤모글로빈은 빛을 적게 흡수한다. 질소가 도핑된 탄소나노입자는 광음향 세기가 커서 생체 내부를 이미징하기에 충분하다. 질소가 도핑된 탄소나노입자는 흡광, 발열 및 광음향 신호 측정 실험을 통해 근적외선 영역에서 빛을 흡수하고 열을 발생시키며 농도가 진해짐에 따라 광음향 신호가 많이 측정되는 것을 확인하였다. 이를 응용하여 림프노드, 장을 이미징 하였으며 오줌으로 배출되는 것을 확인하였고 암 모델에서 광열을 통한 치료 효과를 확인할 수 있었다. 질소가 도핑된 탄소나노입자는 광음향 이미징에서의 광학적 대비효과를 높이고 암치료를 위한 광열치료 효과를 높이는데 이용될 수 있는 물질임을 확인하였다. 본 박사학위 과정 동안 광 활성 나노소재를 이용한 이광자 및 광음향 시스템에 대한 연구를 수행하여 다양한 의료영상 및 치료 시스템으로 개발하는 연구를 성공적으로 수행하였다

Hyaluronate Modified Upconversion Nanoparticles for Near Infrared Light-triggered on-off Tattoo Systems

An in vivo on-off tattoo system was developed using upconversion nanoparticles conjugated with hyaluronate (HA-UCNPs). Two-photon microscopy clearly visualized the transdermal delivery of HA-UCNPs into the deep skin tissue. Upon near-infrared light irradiation, invisible HA-UCNPs in the skin were visualized showing the feasibility as a new on-off tattoo system.111Nsciescopu

Hyaluronate and Its Derivatives for Customized Biomedical Applications

Since hyaluronate (HA) was firstly isolated from the vitreous of bovine eyes in 1934, HA has been widely investigated for various biomedical applications. As a naturally-occurring polysaccharide, HA has been used for joint lubrication and ocular treatment in its intact form due to the excellent biocompatibility, viscoelasticity, biodegradability, and hygroscopic properties. HA can be easily functionalized via the chemical modification of its carboxyl and hydroxyl groups. Recently, a variety of biological functions of HA have been explored and a number of customized applications have been investigated taking advantages of the interaction between HA and biological tissues. HA has been used for drug delivery to enhance the blood circulation time of drugs with target-specificity to HA receptors in the body. HA has been also used to prepare tissue engineering hydrogel scaffolds for the spatiotemporal control of encapsulated cells. In this review, we describe the key biological functions of HA in the body in terms of its structure, physical properties, biodistribution and interaction with HA receptors. After that, we describe unique advantages that allow HA to be applied in various biomedical fields. Finally, we report the conventional and newly emerging applications of HA and its derivatives under commercial development stages.1114sciescopu