ARD1 단백질과 산화·환원 민감성 전사인자 NRF2와의 상호작용이 대장암 진행에 미치는 영향 및 기전연구

학위논문(박사) -- 서울대학교대학원 : 약학대학 약학과, 2023. 2. 서영준.Nuclear factor erythroid-2-related factor 2 (NRF2)는 산화적 또는 친전자적 스트레스에 대항하는 항산화 효소들의 발현을 조절하는 전사인자로, 염증, 노화 및 암의 발생과 같은 다양한 병리적 현상으로부터 세포를 보호하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 최근 여러 암세포에서 NRF2는 종양 증식 및 진행에 관여하며 항암제와 같은 외부 스트레스에 대한 보호기전으로 작용한다. 암세포에서 비정상적인 NRF2의 과발현은 NRF2의 대표적 음성조절자인 KEAP1의 비활성화나 NRF2의 자체의 체세포 변이를 통해 발생하는 것으로 알려져 있지만 NRF2의 지속적인 활성화를 담당하는 대안적인 (alternative) 기전에 관해서는 명확히 규명된 바가 없다. N-아세틸화 효소로 알려진 arrest defective1 protein (ARD1)은 세포 분열, 증식 및 발암기전에 관여하며 산화적 스트레스에 대한 세포내 보호작용에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. ARD1은 유방암, 전립선암, 폐암, 간암, 자궁경부암, 방광암, 대장암에서 높게 발현되어 있으며 ARD1의 발현이 높을수록 암 환자들의 낮은 생존율이 보고된 바 있다. 번역 후 변형 형태 중 하나인 아세틸화는 단백질의 안정화에 관여하며, NRF2 아미노산 염기서열 내에 아세틸화가 가능한 라이신 잔기가 있음에도 불구하고 아세틸화에 의한 NRF2의 안정화 기전 관한 연구는 크게 이루어진 바가 없다. 본 연구에서는 ARD1이 NRF2의 아세틸화를 유도함으로서 대장암의 진행과정에 관여하는 분자 기전에 관하여 알아보고자 하였다. 면역형광염색 기법을 통하여 인체대장암 조직을 염색해 보았을때 ARD1과 NRF2의 발현이 서로 positive한 상관 관계를 보였으며, ARD1 유전자 발현을 선택적으로 억제할 수 있는 siRNA를 인체 대장암 세포주에 주입하였을 때 NRF2의 mRNA에는 영향을 미치지 못하였으나 NRF2의 단백질이 유의적으로 감소되었다. 이는 ARD1이 NRF2의 신생 합성에 관여하는 것이 아닌 단백질 번역 후 변형에 관여함을 시사하였다. 또한, 이 두 단백질은 인간 대장암 세포인 HCT-116와 인간 대장 종양 조직에서 물리적으로 상호작용함을 관찰하였으며 NRF2의 serial deletion construct를 통하여 NRF2의 Neh1와 Neh3 domain이 두 단백질의 결합에 직접 관여함을 알 수 있었다. ARD1의 과발현시 NRF2의 아세틸화가 증가되었으며 in vitro acetylation assay와 질량분석법을 통해 ARD1이 NRF2를 직접 아세틸화시킬 수 있음을 증명하였다. ARD1의 아세틸화 효소활성이 NRF2의 단백질 안정화에 관여하는지 확인하고자 아세틸화 효소활성 기능이 손상된 ARD1 돌연변이를 통하여 NRF2 단백질의 반감기를 측정한 결과 ARD1을 통한 NRF2의 아세틸화가 단백질 안정화에 관여함을 확인할 수 있었다. 결론적으로, ARD1은 NRF2의 아세틸화를 통하여 단백질 안정화에 관여하며 인간 대장암 세포의 이동 및 증식과 같은 암의 진행과정 참여한다.Aberrant overactivation/overexpression of NRF2 is implicated in tumor progression, which has been largely attributed to its mutation as well as inactivation of the inhibitory protein, KEAP1. However, alternative mechanisms responsible for sustained activation of NRF2 are less understood. Here, I showed that ARD1 with the acetyltransferase activity is a new regulator of NRF2. Elevated levels of ARD1 and NRF2 were detected in human colon tumor tissues as well as human colon cancer cell lines. Knockdown of both ARD1 and NRF2 in human colon cancer HCT-116 cells suppressed the oncogenicity of these cells. Furthermore, ARD1 knockdown in human colon cancer cells significantly reduced the protein levels of NRF2 without affecting its mRNA expression; however, silencing of NRF2 did not alter ARD1 protein expression. In addition, these two proteins were co-localized and physically interacted with each other both in human colon cancer cells and human colon tumor tissues. Mechanistically, ARD1 overexpression increased the acetylation levels of NRF2. Moreover, the in vitro acetylation assay and mass spectrometric analysis demonstrated that ARD1 directly acetylated NRF2. Ectopic expression of mutant forms of ARD1 with defective acetyltransferase activity reduced the half-life of NRF2. In conclusion, ARD1 may potentiate the oncogenic function of NRF2 in human colon cancer by acetylating and stabilizing this transcription factor.Chapter Ⅰ. ARD1-mediated Lysine Acetylation as a Novel Post-translational Modification of NRF2 1 1. Introduction 2 Ⅰ. NRF2 5 1. NRF2 protein 8 2. Phosorylation of NRF2 11 3 Ubiquitylation of NRF2. 20 4. Acetylation of NRF2 24 5. Deacetylation of NRF2 30 6. SUMOylation of NRF2 31 7. Glycation and de-glycation of NRF2 33 8. Methylation of NRF2 33 9. Concluding remarks 34 Ⅱ. ARD1 39 1. Discovery of ARD1 39 2. ARD1 isoforms 39 3. ARD1 as a lysine acetyltransferase 40 4. Concluding remarks 45 Ⅲ. References 47 STATEMENT OF PURPOSE 62 Chapter Ⅱ. ARD1 stabilizes NRF2 through direct interaction and promotes colon cancer progression 64 1. Introduction 65 2. Materials and Methods 68 3. Results 82 3.1 Correlation of NRF2 and ARD1 with CRC 82 3.2 Knockdown of NRF2 and ARD1 attenuates oncogenicity of CRC cells 88 3.3 ARD1 knockdown reduces the stability of NRF2 in human colon cancer cells 94 3.4 ARD1 physically interacts with NRF2 105 3.5 ARD1 decreases cellular responses to oxidative stress in HCT-116 cells 114 3.6 ARD1 knockdown reduces the stability of NRF2 in human colon cancer cells 116 4. Discussion 124 5. Conclusion 128 6. References 131 Abstract in Korean 136박