식중독균 다중 검출 및 식별을 위한 새로운 차세대 시퀀싱 패널 방법

학위논문(석사) -- 서울대학교대학원 : 농업생명과학대학 농생명공학부, 2023. 2. 이주훈.복잡한 균 총을 가지고 있는 식품 속에서 식중독 사고의 원인 균 만을 감지하고 식별하는 것은 중요하다. 현재까지 사용되고 있는 식중독균 검출 및 식별 기술은 위와 같은 목표를 달성하기 위해 여러 문제점들을 해결해왔지만, 동시다발적으로 다양한 식중독균을 검출하는데 있어서 한계점을 나타냈다. 따라서, 한 번의 반응으로 다양한 식중독 원인 균을 효율적으로 선별하고 식별할 수 있다고 보고된 NGS 패널 기술을 활용하여 새로운 식중독균 검출 및 식별 기술을 개발하였다. 본 연구에서는 2 가지의 NGS 패널로 각각 6 종 및 7 종의 식중독균 (세트1: Bacillus cereus, Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus 및 Vibrio vulnificus, 세트2: Listeria monocytogenes, Salmonella enterica serovar Typhimurium, enteropathogenic Escherichia coli [EPEC], enteroinvasive E. coli [EIEC], enterotoxigenic E. coli [ETEC], enterohemorrhagic E. coli [EHEC], 및 enteroaggregative E. coli [EAEC clinical (EAEC)])안에서 18 개 및 13 개의 특이적인 독성 인자 유전자를 표적으로 하는 새로운 NGS 패널 프라이머 세트를 개발하고 최적화했다. 프라이머 세트를 이용한 싱글플렉스 PCR에서는 예측된 크기의 단일 PCR 앰플리콘이 나타났고, 이후의 교차 확인 및 멀티플렉스 PCR에서는 비특이적 프라이머 세트 또는 비특이적 식중독 균의 DNA에 의한 간섭이 나타나지 않아 새로운 프라이머 세트의 특이성과 선택성을 확인했다. 이후, 새로운 NGS 패널 방법의 평가를 위해 수집된 6개의 서로 다른 농업용수 샘플과 6개의 서로 다른 발효식품에 각각 6 종과 7 종의 식중독균을 동시 오염시킨 후 NGS 패널 분석을 진행하였다. 그 결과, 농업용수에서는 108~105 CFUs 수준에서 18 개의 표적 유전자가, 발효식품에서는 식중독균 종 당 108~107 CFUs 수준에서 13 개의 표적 유전자가 다중 검출 및 식별되었다. 또한, 독성 인자 유전자의 평균 총 서열 판독 횟수는 표적 병원체당 CFU와 양의 상관관계가 있었다. 하지만, NGS 패널 분석은 한 반응에서 다양한 종의 식중독균을 동시 검출하는 이점을 보여주었지만, 적은 CFU (희석 계수 106-105)의 식중독균이 오염된 샘플에서 상대적으로 낮은 감도와 위양성 결과가 발생했다. 추가적으로, NGS 패널 결과를 검증하기 위해 동일한 오염된 농업용수 및 발효식품 샘플을 사용하여 두가지 세트 및 세가지 세트의 qPCR 분석을 수행했으며, 표적 병원체 검출 및 식별의 효율성 및 특이성은 NGS 패널 분석과 유사했다. 비교 통계 분석 및 Spearman 상관 분석은 NGS 패널 서열 판독 횟수와 qPCR 주기 임계값(Ct) 값이 음의 연관이 있음을 보여주었으며 결과의 유사성을 나타내었다. 보다 빠르고 정확한 검출 및 식별을 위해 NGS 패널 분석을 향상시키려면 NGS 패널 프라이머 세트의 추가적인 최적화와 실시간 NGS 시퀀싱 기술의 도입이 필요하다. 결과적으로, 위 연구를 통해 식품 매개 병원체의 다중 검출을 위한 NGS 패널 분석의 적용에 대한 잠재력과 이점들을 확인하였다.Detecting and identifying the bacterial origin of foodborne pathogen outbreaks is challenging. However, the NGS panel method could potentially be used to efficiently screen and identify the outbreak origin of various bacteria in one reaction. In this study, two sets of new NGS panel primer sets targeting 18 and 13 specific virulence factor genes from (a) Bacillus cereus, Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, and V. vulnificus (b) five types of pathogenic Escherichia coli (enteropathogenic E. coli [EPEC], enteroinvasive E. coli [EIEC], enterotoxigenic E. coli [ETEC], enterohemorrhagic E. coli [EHEC], and enteroaggregative E. coli [EAEC clinical (EAEC)])), Listeria monocytogenes, and Salmonella enterica serovar Typhimurium, respectively, were developed and optimized. Singleplex PCR with the primer sets revealed a single PCR amplicon with the expected size, and a subsequent crosscheck and multiplex PCR revealed no interference in the primer set mixture or pathogenic DNA mixture, thereby confirming the specificity and selectivity of the new primer sets. In an evaluation of the new NGS panel method, six collected agricultural water samples were contaminated with the six selected foodborne pathogens, and six collected fermented food samples were contaminated with the seven selected foodborne pathogens. NGS panel analysis revealed that 18 target genes were multi-detected in one reaction at 108 to 105 CFUs per target pathogen and 13 target genes were multi-detected in one reaction at 108 to 107. Interestingly, the average total sequence read counts from the virulence factor genes were positively associated with the CFUs per target pathogen. Although the NGS panel analysis indicated the advantage of multiple pathogen detection in one reaction, relatively low sensitivity and false positive results occurred with few CFUs (dilution factor of 105 in agricultural water and 106-105 in fermented foods) of the target pathogens. To validate the multiple detection and identification results, two sets and three sets of qPCR analyses were independently performed using the same contaminated agricultural water samples and fermented food samples, respectively, and the efficiency and specificity of target pathogen detection and identification were like those in the NGS panel analysis. Indeed, comparative statistical analysis and Spearman correlation analysis revealed that the NGS panel sequence read counts and qPCR cycle threshold (Ct) values were negatively associated, supporting the similarity of the results. To further improve NGS panel analysis for more rapid and accurate detection and identification, the NGS panel primer sets must be further optimized and real-time NGS sequencing technology should be used. Nevertheless, this study provides new insights into the application of NGS panel analysis for the multiple detection of foodborne pathogens.1. Introduction 1 2. Materials and Methods 8 2.1. Bacterial strains, media, and growth conditions 8 2.2. Isolation of foodborne pathogens 9 2.3. DNA extraction 11 2.4. 16S rRNA gene sequencing 12 2.5. Pathogenic identification of E. coli using PCR 13 2.6. Genome sequencing and analysis 13 2.7. NGS panel primer design and optimization 14 2.8. Singleplex PCR and crosscheck PCR 15 2.9. Multiplex PCR 16 2.10. Collection of agricultural water samples and the preparation of contaminated water samples with selected pathogens 17 2.11. Collection of fermented food samples and the preparation of contaminated fermented food samples with selected pathogens 18 2.12. NGS panel analysis 20 2.13. Quantitative real-time PCR (qPCR) 21 2.14. Statistical analysis 22 3. Results 23 3.1. NGS panel set 1: multiple detection and identification of foodborne pathogens in agricultural water 23 3.1.1. Isolation and identification of foodborne pathogens 23 3.1.2. General genome features of selected foodborne pathogens and the design of primer sets 24 3.1.3. Validation of designed primer sets 29 3.1.3.1 Singleplex PCR 29 3.1.3.2 Crosscheck PCR 31 3.1.3.3 Multiplex PCR 35 3.1.4. NGS panel analysis 37 3.1.5. qPCR analysis 51 3.1.6. Comparative evaluation of NGS panel analysis and qPCR 51 3.2. NGS panel set 2: multiple detection and identification of foodborne pathogens in fermented foods 61 3.2.1. Isolation and identification of foodborne pathogens 61 3.2.2. General genome features of selected foodborne pathogens and the design of primer sets 63 3.2.3. Validation of designed primer sets 68 3.2.3.1 Singleplex PCR 68 3.2.3.2 Crosscheck PCR 70 3.2.3.3 Multiplex PCR 74 3.2.4. NGS panel analysis 76 3.2.5. qPCR analysis 89 3.2.6. Comparative evaluation of NGS panel analysis and qPCR 96 4. Discussion 99 5. References 102 국문초록 112석

조국통일방도의 모색

여러분! 통일의 열망을 안고 남조선과 해외 여러 곳에서 오신 선생님들과 이렇게 자리를 같이하고 통일토론회를 가지게 된 데 대하여 우리는 매우 기쁘게 생각합니다. 북에서 온 저희들은 지금까지 해외에 계시는 학자들과는 여러 번 만나 통일에 대하여 이야기를 나눌 수 있었지만 오늘처럼 해외 학자뿐 아니라 남조선 학자들과도 만나 한 자리에서 민족의 대단결과 통일방도에 대하여 여러모로 진지하게 의견을 나누기는 처음이라고 생각합니다. 북과 남, 해외동포 학자들이 다 같이 참석한 오늘의 통일토론회는 비록 소박하고 차분하게 진행되고 있지만 북과 남， 해외에서 일어나고 있는 통일노력을 민간급에서 결집시켜 나가는 데서 실로 작지 않은 의의를 가지게 될 것으로 확신하고 있습니다. 저는 오늘의 이 소중한 모임을 마련하시고 토론회의 성과적 진행을 위하여 온갖 편의를 다 돌보고 계시는 주최 측에 뜨거운 인사를 드립니다. 저는 이 뜻깊은 자리에서 먼저 우리 조국의 통일을 위하여 누구보다도 많은 심혈을 기울이시고 통일로상에 불멸의 업적을 남기신 경애하는 수령 김일성 통지의 로고에 대하여 다시 한번 돌이켜 보게 됩니다. 여러분들도 다 잘 알고 게시는 바와 같이 경애하는 수령님께서는 영생불멸의 주체사상에 기초하시여 조국통일에 관한 사상과 리론올 전면적으로 밝히시고 특히 우리나라의 구체적 실정으로부터 출발하시어 련방제방식으로 조국올 통일할 데 대한 리론을 독창적으로 밝히시었습니다. 경애하는 수령님께서 안겨주신 조국통일 리론과 련방제 통일방안은 우리겨레가 받아안은 고귀한 유산의 한 부분이고 통일의 성스러운 길에서 언제나 앞장서 있어야 할 저회들 학자들이 소중히 간직하여야 할 우리 민족의 정신적 재부의 하나라고 인정합니다

통일의 방식 - 토론

이정식(사회, 미국 펜실베니아대학 정치학과 교수): 회의를 속개하겠습니다. 아까 주최측의 말씀이 오후는 종합토론인데 역시 토론이니까 아침에 남은 시간 1시간 30분 동안의 토론을 오후에 계속하는 형식이 되겠습니다. 그래서 시간의 제약을 너무 받지 말고 토론을 하도록 하고 질문을 하실 경우에 평양에서 오신 분들께서는 대답을 오후에 하시면 좋겠다는 말씀이 계셔서 그러면 지금 대답을 하셔도 좋고 유보하셨다가 오후에 하셔도 되겠습니다. 사회자로선 특별히 말씀드릴 것은 없습니다만 여러분들의 발표를 듣고 있으면서 한가지만 말씀드리려고 하는 것이 있습니다. 우리가 통일이라는 얘기를 하는데 과연 통일이 무엇인가, 통일이 되었을 때 그 형태가 무엇인가 하는 것을 별로 정의를 내리지 않고 우리가 토론을 하고 있다는 생각이 듭니다. 그래서 그런 문제에 대해 좀 토의가 됐으면 좋겠는데 북쪽에서 말씀하시고 있는 통일이라는 것은 역시 연합제가 성립된 말하자면 1민족 1국가 2체제가 통일이고 이남에서 얘기하고 있는 것은 1민족 1국가 1체제입니다