30 research outputs found
์์ค๋ ๊ท ๋ค์ค ๊ฒ์ถ ๋ฐ ์๋ณ์ ์ํ ์๋ก์ด ์ฐจ์ธ๋ ์ํ์ฑ ํจ๋ ๋ฐฉ๋ฒ
ํ์๋
ผ๋ฌธ(์์ฌ) -- ์์ธ๋ํ๊ต๋ํ์ : ๋์
์๋ช
๊ณผํ๋ํ ๋์๋ช
๊ณตํ๋ถ, 2023. 2. ์ด์ฃผํ.๋ณต์กํ ๊ท ์ด์ ๊ฐ์ง๊ณ ์๋ ์ํ ์์์ ์์ค๋
์ฌ๊ณ ์ ์์ธ ๊ท ๋ง์ ๊ฐ์งํ๊ณ ์๋ณํ๋ ๊ฒ์ ์ค์ํ๋ค. ํ์ฌ๊น์ง ์ฌ์ฉ๋๊ณ ์๋ ์์ค๋
๊ท ๊ฒ์ถ ๋ฐ ์๋ณ ๊ธฐ์ ์ ์์ ๊ฐ์ ๋ชฉํ๋ฅผ ๋ฌ์ฑํ๊ธฐ ์ํด ์ฌ๋ฌ ๋ฌธ์ ์ ๋ค์ ํด๊ฒฐํด์์ง๋ง, ๋์๋ค๋ฐ์ ์ผ๋ก ๋ค์ํ ์์ค๋
๊ท ์ ๊ฒ์ถํ๋๋ฐ ์์ด์ ํ๊ณ์ ์ ๋ํ๋๋ค. ๋ฐ๋ผ์, ํ ๋ฒ์ ๋ฐ์์ผ๋ก ๋ค์ํ ์์ค๋
์์ธ ๊ท ์ ํจ์จ์ ์ผ๋ก ์ ๋ณํ๊ณ ์๋ณํ ์ ์๋ค๊ณ ๋ณด๊ณ ๋ NGS ํจ๋ ๊ธฐ์ ์ ํ์ฉํ์ฌ ์๋ก์ด ์์ค๋
๊ท ๊ฒ์ถ ๋ฐ ์๋ณ ๊ธฐ์ ์ ๊ฐ๋ฐํ์๋ค.
๋ณธ ์ฐ๊ตฌ์์๋ 2 ๊ฐ์ง์ NGS ํจ๋๋ก ๊ฐ๊ฐ 6 ์ข
๋ฐ 7 ์ข
์ ์์ค๋
๊ท (์ธํธ1: Bacillus cereus, Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus ๋ฐ Vibrio vulnificus, ์ธํธ2: Listeria monocytogenes, Salmonella enterica serovar Typhimurium, enteropathogenic Escherichia coli [EPEC], enteroinvasive E. coli [EIEC], enterotoxigenic E. coli [ETEC], enterohemorrhagic E. coli [EHEC], ๋ฐ enteroaggregative E. coli [EAEC clinical (EAEC)])์์์ 18 ๊ฐ ๋ฐ 13 ๊ฐ์ ํน์ด์ ์ธ ๋
์ฑ ์ธ์ ์ ์ ์๋ฅผ ํ์ ์ผ๋ก ํ๋ ์๋ก์ด NGS ํจ๋ ํ๋ผ์ด๋จธ ์ธํธ๋ฅผ ๊ฐ๋ฐํ๊ณ ์ต์ ํํ๋ค. ํ๋ผ์ด๋จธ ์ธํธ๋ฅผ ์ด์ฉํ ์ฑ๊ธํ๋ ์ค PCR์์๋ ์์ธก๋ ํฌ๊ธฐ์ ๋จ์ผ PCR ์ฐํ๋ฆฌ์ฝ์ด ๋ํ๋ฌ๊ณ , ์ดํ์ ๊ต์ฐจ ํ์ธ ๋ฐ ๋ฉํฐํ๋ ์ค PCR์์๋ ๋นํน์ด์ ํ๋ผ์ด๋จธ ์ธํธ ๋๋ ๋นํน์ด์ ์์ค๋
๊ท ์ DNA์ ์ํ ๊ฐ์ญ์ด ๋ํ๋์ง ์์ ์๋ก์ด ํ๋ผ์ด๋จธ ์ธํธ์ ํน์ด์ฑ๊ณผ ์ ํ์ฑ์ ํ์ธํ๋ค.
์ดํ, ์๋ก์ด NGS ํจ๋ ๋ฐฉ๋ฒ์ ํ๊ฐ๋ฅผ ์ํด ์์ง๋ 6๊ฐ์ ์๋ก ๋ค๋ฅธ ๋์
์ฉ์ ์ํ๊ณผ 6๊ฐ์ ์๋ก ๋ค๋ฅธ ๋ฐํจ์ํ์ ๊ฐ๊ฐ 6 ์ข
๊ณผ 7 ์ข
์ ์์ค๋
๊ท ์ ๋์ ์ค์ผ์ํจ ํ NGS ํจ๋ ๋ถ์์ ์งํํ์๋ค. ๊ทธ ๊ฒฐ๊ณผ, ๋์
์ฉ์์์๋ 108~105 CFUs ์์ค์์ 18 ๊ฐ์ ํ์ ์ ์ ์๊ฐ, ๋ฐํจ์ํ์์๋ ์์ค๋
๊ท ์ข
๋น 108~107 CFUs ์์ค์์ 13 ๊ฐ์ ํ์ ์ ์ ์๊ฐ ๋ค์ค ๊ฒ์ถ ๋ฐ ์๋ณ๋์๋ค. ๋ํ, ๋
์ฑ ์ธ์ ์ ์ ์์ ํ๊ท ์ด ์์ด ํ๋
ํ์๋ ํ์ ๋ณ์์ฒด๋น CFU์ ์์ ์๊ด๊ด๊ณ๊ฐ ์์๋ค. ํ์ง๋ง, NGS ํจ๋ ๋ถ์์ ํ ๋ฐ์์์ ๋ค์ํ ์ข
์ ์์ค๋
๊ท ์ ๋์ ๊ฒ์ถํ๋ ์ด์ ์ ๋ณด์ฌ์ฃผ์์ง๋ง, ์ ์ CFU (ํฌ์ ๊ณ์ 106-105)์ ์์ค๋
๊ท ์ด ์ค์ผ๋ ์ํ์์ ์๋์ ์ผ๋ก ๋ฎ์ ๊ฐ๋์ ์์์ฑ ๊ฒฐ๊ณผ๊ฐ ๋ฐ์ํ๋ค. ์ถ๊ฐ์ ์ผ๋ก, NGS ํจ๋ ๊ฒฐ๊ณผ๋ฅผ ๊ฒ์ฆํ๊ธฐ ์ํด ๋์ผํ ์ค์ผ๋ ๋์
์ฉ์ ๋ฐ ๋ฐํจ์ํ ์ํ์ ์ฌ์ฉํ์ฌ ๋๊ฐ์ง ์ธํธ ๋ฐ ์ธ๊ฐ์ง ์ธํธ์ qPCR ๋ถ์์ ์ํํ์ผ๋ฉฐ, ํ์ ๋ณ์์ฒด ๊ฒ์ถ ๋ฐ ์๋ณ์ ํจ์จ์ฑ ๋ฐ ํน์ด์ฑ์ NGS ํจ๋ ๋ถ์๊ณผ ์ ์ฌํ๋ค. ๋น๊ต ํต๊ณ ๋ถ์ ๋ฐ Spearman ์๊ด ๋ถ์์ NGS ํจ๋ ์์ด ํ๋
ํ์์ qPCR ์ฃผ๊ธฐ ์๊ณ๊ฐ(Ct) ๊ฐ์ด ์์ ์ฐ๊ด์ด ์์์ ๋ณด์ฌ์ฃผ์์ผ๋ฉฐ ๊ฒฐ๊ณผ์ ์ ์ฌ์ฑ์ ๋ํ๋ด์๋ค.
๋ณด๋ค ๋น ๋ฅด๊ณ ์ ํํ ๊ฒ์ถ ๋ฐ ์๋ณ์ ์ํด NGS ํจ๋ ๋ถ์์ ํฅ์์ํค๋ ค๋ฉด NGS ํจ๋ ํ๋ผ์ด๋จธ ์ธํธ์ ์ถ๊ฐ์ ์ธ ์ต์ ํ์ ์ค์๊ฐ NGS ์ํ์ฑ ๊ธฐ์ ์ ๋์
์ด ํ์ํ๋ค. ๊ฒฐ๊ณผ์ ์ผ๋ก, ์ ์ฐ๊ตฌ๋ฅผ ํตํด ์ํ ๋งค๊ฐ ๋ณ์์ฒด์ ๋ค์ค ๊ฒ์ถ์ ์ํ NGS ํจ๋ ๋ถ์์ ์ ์ฉ์ ๋ํ ์ ์ฌ๋ ฅ๊ณผ ์ด์ ๋ค์ ํ์ธํ์๋ค.Detecting and identifying the bacterial origin of foodborne pathogen outbreaks is challenging. However, the NGS panel method could potentially be used to efficiently screen and identify the outbreak origin of various bacteria in one reaction. In this study, two sets of new NGS panel primer sets targeting 18 and 13 specific virulence factor genes from (a) Bacillus cereus, Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, and V. vulnificus (b) five types of pathogenic Escherichia coli (enteropathogenic E. coli [EPEC], enteroinvasive E. coli [EIEC], enterotoxigenic E. coli [ETEC], enterohemorrhagic E. coli [EHEC], and enteroaggregative E. coli [EAEC clinical (EAEC)])), Listeria monocytogenes, and Salmonella enterica serovar Typhimurium, respectively, were developed and optimized. Singleplex PCR with the primer sets revealed a single PCR amplicon with the expected size, and a subsequent crosscheck and multiplex PCR revealed no interference in the primer set mixture or pathogenic DNA mixture, thereby confirming the specificity and selectivity of the new primer sets. In an evaluation of the new NGS panel method, six collected agricultural water samples were contaminated with the six selected foodborne pathogens, and six collected fermented food samples were contaminated with the seven selected foodborne pathogens. NGS panel analysis revealed that 18 target genes were multi-detected in one reaction at 108 to 105 CFUs per target pathogen and 13 target genes were multi-detected in one reaction at 108 to 107. Interestingly, the average total sequence read counts from the virulence factor genes were positively associated with the CFUs per target pathogen. Although the NGS panel analysis indicated the advantage of multiple pathogen detection in one reaction, relatively low sensitivity and false positive results occurred with few CFUs (dilution factor of 105 in agricultural water and 106-105 in fermented foods) of the target pathogens. To validate the multiple detection and identification results, two sets and three sets of qPCR analyses were independently performed using the same contaminated agricultural water samples and fermented food samples, respectively, and the efficiency and specificity of target pathogen detection and identification were like those in the NGS panel analysis. Indeed, comparative statistical analysis and Spearman correlation analysis revealed that the NGS panel sequence read counts and qPCR cycle threshold (Ct) values were negatively associated, supporting the similarity of the results. To further improve NGS panel analysis for more rapid and accurate detection and identification, the NGS panel primer sets must be further optimized and real-time NGS sequencing technology should be used. Nevertheless, this study provides new insights into the application of NGS panel analysis for the multiple detection of foodborne pathogens.1. Introduction 1
2. Materials and Methods 8
2.1. Bacterial strains, media, and growth conditions 8
2.2. Isolation of foodborne pathogens 9
2.3. DNA extraction 11
2.4. 16S rRNA gene sequencing 12
2.5. Pathogenic identification of E. coli using PCR 13
2.6. Genome sequencing and analysis 13
2.7. NGS panel primer design and optimization 14
2.8. Singleplex PCR and crosscheck PCR 15
2.9. Multiplex PCR 16
2.10. Collection of agricultural water samples and the preparation of contaminated water samples with selected pathogens 17
2.11. Collection of fermented food samples and the preparation of contaminated fermented food samples with selected pathogens 18
2.12. NGS panel analysis 20
2.13. Quantitative real-time PCR (qPCR) 21
2.14. Statistical analysis 22
3. Results 23
3.1. NGS panel set 1: multiple detection and identification of foodborne pathogens in agricultural water 23
3.1.1. Isolation and identification of foodborne pathogens 23
3.1.2. General genome features of selected foodborne pathogens and the design of primer sets 24
3.1.3. Validation of designed primer sets 29
3.1.3.1 Singleplex PCR 29
3.1.3.2 Crosscheck PCR 31
3.1.3.3 Multiplex PCR 35
3.1.4. NGS panel analysis 37
3.1.5. qPCR analysis 51
3.1.6. Comparative evaluation of NGS panel analysis and qPCR 51
3.2. NGS panel set 2: multiple detection and identification of foodborne pathogens in fermented foods 61
3.2.1. Isolation and identification of foodborne pathogens 61
3.2.2. General genome features of selected foodborne pathogens and the design of primer sets 63
3.2.3. Validation of designed primer sets 68
3.2.3.1 Singleplex PCR 68
3.2.3.2 Crosscheck PCR 70
3.2.3.3 Multiplex PCR 74
3.2.4. NGS panel analysis 76
3.2.5. qPCR analysis 89
3.2.6. Comparative evaluation of NGS panel analysis and qPCR 96
4. Discussion 99
5. References 102
๊ตญ๋ฌธ์ด๋ก 112์
์กฐ๊ตญํต์ผ๋ฐฉ๋์ ๋ชจ์
์ฌ๋ฌ๋ถ! ํต์ผ์ ์ด๋ง์ ์๊ณ ๋จ์กฐ์ ๊ณผ ํด์ธ ์ฌ๋ฌ ๊ณณ์์ ์ค์ ์ ์๋๋ค๊ณผ ์ด๋ ๊ฒ ์๋ฆฌ๋ฅผ ๊ฐ์ดํ๊ณ ํต์ผํ ๋ก ํ๋ฅผ ๊ฐ์ง๊ฒ ๋ ๋ฐ ๋ํ์ฌ ์ฐ๋ฆฌ๋ ๋งค์ฐ ๊ธฐ์๊ฒ ์๊ฐํฉ๋๋ค. ๋ถ์์ ์จ ์ ํฌ๋ค์ ์ง๊ธ๊น์ง ํด์ธ์ ๊ณ์๋ ํ์๋ค๊ณผ๋ ์ฌ๋ฌ ๋ฒ ๋ง๋ ํต์ผ์ ๋ํ์ฌ ์ด์ผ๊ธฐ๋ฅผ ๋๋ ์ ์์์ง๋ง ์ค๋์ฒ๋ผ ํด์ธ ํ์๋ฟ ์๋๋ผ ๋จ์กฐ์ ํ์๋ค๊ณผ๋ ๋ง๋ ํ ์๋ฆฌ์์ ๋ฏผ์กฑ์ ๋๋จ๊ฒฐ๊ณผ ํต์ผ๋ฐฉ๋์ ๋ํ์ฌ ์ฌ๋ฌ๋ชจ๋ก ์ง์งํ๊ฒ ์๊ฒฌ์ ๋๋๊ธฐ๋ ์ฒ์์ด๋ผ๊ณ ์๊ฐํฉ๋๋ค.
๋ถ๊ณผ ๋จ, ํด์ธ๋ํฌ ํ์๋ค์ด ๋ค ๊ฐ์ด ์ฐธ์ํ ์ค๋์ ํต์ผํ ๋ก ํ๋ ๋น๋ก ์๋ฐํ๊ณ ์ฐจ๋ถํ๊ฒ ์งํ๋๊ณ ์์ง๋ง ๋ถ๊ณผ ๋จ๏ผ ํด์ธ์์ ์ผ์ด๋๊ณ ์๋ ํต์ผ๋
ธ๋ ฅ์ ๋ฏผ๊ฐ๊ธ์์ ๊ฒฐ์ง์์ผ ๋๊ฐ๋ ๋ฐ์ ์ค๋ก ์์ง ์์ ์์๋ฅผ ๊ฐ์ง๊ฒ ๋ ๊ฒ์ผ๋ก ํ์ ํ๊ณ ์์ต๋๋ค. ์ ๋ ์ค๋์ ์ด ์์คํ ๋ชจ์์ ๋ง๋ จํ์๊ณ ํ ๋ก ํ์ ์ฑ๊ณผ์ ์งํ์ ์ํ์ฌ ์จ๊ฐ ํธ์๋ฅผ ๋ค ๋๋ณด๊ณ ๊ณ์๋ ์ฃผ์ต ์ธก์ ๋จ๊ฑฐ์ด ์ธ์ฌ๋ฅผ ๋๋ฆฝ๋๋ค. ์ ๋ ์ด ๋ป๊น์ ์๋ฆฌ์์ ๋จผ์ ์ฐ๋ฆฌ ์กฐ๊ตญ์ ํต์ผ์ ์ํ์ฌ ๋๊ตฌ๋ณด๋ค๋ ๋ง์ ์ฌํ์ ๊ธฐ์ธ์ด์๊ณ ํต์ผ๋ก์์ ๋ถ๋ฉธ์ ์
์ ์ ๋จ๊ธฐ์ ๊ฒฝ์ ํ๋ ์๋ น ๊น์ผ์ฑ ํต์ง์ ๋ก๊ณ ์ ๋ํ์ฌ ๋ค์ ํ๋ฒ ๋์ด์ผ ๋ณด๊ฒ ๋ฉ๋๋ค. ์ฌ๋ฌ๋ถ๋ค๋ ๋ค ์ ์๊ณ ๊ฒ์๋ ๋ฐ์ ๊ฐ์ด ๊ฒฝ์ ํ๋ ์๋ น๋๊ป์๋ ์์๋ถ๋ฉธ์ ์ฃผ์ฒด์ฌ์์ ๊ธฐ์ดํ์์ฌ ์กฐ๊ตญํต์ผ์ ๊ดํ ์ฌ์๊ณผ ๋ฆฌ๋ก ์ฌ ์ ๋ฉด์ ์ผ๋ก ๋ฐํ์๊ณ ํนํ ์ฐ๋ฆฌ๋๋ผ์ ๊ตฌ์ฒด์ ์ค์ ์ผ๋ก๋ถํฐ ์ถ๋ฐํ์์ด ๋ จ๋ฐฉ์ ๋ฐฉ์์ผ๋ก ์กฐ๊ตญ์ฌ ํต์ผํ ๋ฐ ๋ํ ๋ฆฌ๋ก ์ ๋
์ฐฝ์ ์ผ๋ก ๋ฐํ์์์ต๋๋ค. ๊ฒฝ์ ํ๋ ์๋ น๋๊ป์ ์๊ฒจ์ฃผ์ ์กฐ๊ตญํต์ผ ๋ฆฌ๋ก ๊ณผ ๋ จ๋ฐฉ์ ํต์ผ๋ฐฉ์์ ์ฐ๋ฆฌ๊ฒจ๋ ๊ฐ ๋ฐ์์์ ๊ณ ๊ทํ ์ ์ฐ์ ํ ๋ถ๋ถ์ด๊ณ ํต์ผ์ ์ฑ์ค๋ฌ์ด ๊ธธ์์ ์ธ์ ๋ ์์ฅ์ ์์ด์ผ ํ ์ ํ๋ค ํ์๋ค์ด ์์คํ ๊ฐ์งํ์ฌ์ผ ํ ์ฐ๋ฆฌ ๋ฏผ์กฑ์ ์ ์ ์ ์ฌ๋ถ์ ํ๋๋ผ๊ณ ์ธ์ ํฉ๋๋ค
ํต์ผ์ ๋ฐฉ์ - ํ ๋ก
์ด์ ์(์ฌํ, ๋ฏธ๊ตญ ํ์ค๋ฒ ๋์๋ํ ์ ์นํ๊ณผ ๊ต์): ํ์๋ฅผ ์๊ฐํ๊ฒ ์ต๋๋ค. ์๊น ์ฃผ์ต์ธก์ ๋ง์์ด ์คํ๋ ์ข
ํฉํ ๋ก ์ธ๋ฐ ์ญ์ ํ ๋ก ์ด๋๊น ์์นจ์ ๋จ์ ์๊ฐ 1์๊ฐ 30๋ถ ๋์์ ํ ๋ก ์ ์คํ์ ๊ณ์ํ๋ ํ์์ด ๋๊ฒ ์ต๋๋ค. ๊ทธ๋์ ์๊ฐ์ ์ ์ฝ์ ๋๋ฌด ๋ฐ์ง ๋ง๊ณ ํ ๋ก ์ ํ๋๋ก ํ๊ณ ์ง๋ฌธ์ ํ์ค ๊ฒฝ์ฐ์ ํ์์์ ์ค์ ๋ถ๋ค๊ป์๋ ๋๋ต์ ์คํ์ ํ์๋ฉด ์ข๊ฒ ๋ค๋ ๋ง์์ด ๊ณ์
์ ๊ทธ๋ฌ๋ฉด ์ง๊ธ ๋๋ต์ ํ์
๋ ์ข๊ณ ์ ๋ณดํ์
จ๋ค๊ฐ ์คํ์ ํ์
๋ ๋๊ฒ ์ต๋๋ค. ์ฌํ์๋ก์ ํน๋ณํ ๋ง์๋๋ฆด ๊ฒ์ ์์ต๋๋ค๋ง ์ฌ๋ฌ๋ถ๋ค์ ๋ฐํ๋ฅผ ๋ฃ๊ณ ์์ผ๋ฉด์ ํ๊ฐ์ง๋ง ๋ง์๋๋ฆฌ๋ ค๊ณ ํ๋ ๊ฒ์ด ์์ต๋๋ค. ์ฐ๋ฆฌ๊ฐ ํต์ผ์ด๋ผ๋ ์๊ธฐ๋ฅผ ํ๋๋ฐ ๊ณผ์ฐ ํต์ผ์ด ๋ฌด์์ธ๊ฐ, ํต์ผ์ด ๋์์ ๋ ๊ทธ ํํ๊ฐ ๋ฌด์์ธ๊ฐ ํ๋ ๊ฒ์ ๋ณ๋ก ์ ์๋ฅผ ๋ด๋ฆฌ์ง ์๊ณ ์ฐ๋ฆฌ๊ฐ ํ ๋ก ์ ํ๊ณ ์๋ค๋ ์๊ฐ์ด ๋ญ๋๋ค. ๊ทธ๋์ ๊ทธ๋ฐ ๋ฌธ์ ์ ๋ํด ์ข ํ ์๊ฐ ๋์ผ๋ฉด ์ข๊ฒ ๋๋ฐ ๋ถ์ชฝ์์ ๋ง์ํ์๊ณ ์๋ ํต์ผ์ด๋ผ๋ ๊ฒ์ ์ญ์ ์ฐํฉ์ ๊ฐ ์ฑ๋ฆฝ๋ ๋งํ์๋ฉด 1๋ฏผ์กฑ 1๊ตญ๊ฐ 2์ฒด์ ๊ฐ ํต์ผ์ด๊ณ ์ด๋จ์์ ์๊ธฐํ๊ณ ์๋ ๊ฒ์ 1๋ฏผ์กฑ 1๊ตญ๊ฐ 1์ฒด์ ์
๋๋ค