Identification and Characterization of Diadegma fenestrale Ichnovirus (DfIV) and Plasticity of Its Genome Expression Patterns in Parasitized Hosts

학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 농생명공학부, 2013. 8. 이시혁.포식기생은 곤충의 여섯 목(order)에서 발견되며 그 중 벌목 특히 맵시벌상과가 가장 많은 수를 차지한다. 맵시벌상과는 4개과, 6만종 이상을 포함하는 벌목 중 가장 큰 상과이다. 이렇게 종이 다양 할 수 있는 이유는 바로 폴리드나바이러스와 같은 공생 요인이 있기때문이다. 폴리드나바이러스는 Polydnaviridae에 속하며 일부 맵시벌상과내 기생봉에 따라 브라코바이러스 (고치벌과) 와 이크노바이러스 (맵시벌과)로 나뉘게 된다. 본 연구에서는 감자뿔나방살이자루맵시벌 이크노바이러스 (Diadegma fenestrale ichnovirusDfIV) 라고 명명한 새로운 폴리드나바이러스를 감자뿔나방살이자루맵시벌 암컷 난소, 특히 난소받침에서 발견하였다. DfIV는 이중막 구조의 전형적인 이크노바이러스 형태를 보였으며, 조각형 유전체를 갖는 폴리드나바이러스의 특성을 가지고 있었다. 전체 65개의 분리된 유전체 고리를 확인하였으며 247,191bp 전체 염기서열을 읽고 분석하였다. 65개의 유전체 고리의 상대적인 양은 다양했으며 그중 62개가 HfIV와 유사도가 높았고, 평균 GC함량은 43.3% 였다. 전체 99개의 해독틀을 다음과 같이 예측하였다. 40개의 rep, 12개의 cys-motif, 8개의 vankyrin, 6개의 vinnexin, 2개의 polar-residue rich, 1개의 N유전자 그리고 위의 유전자 집단에 포합되지 않는 30개의 유전자. 감자뿔나방살이자루맵시벌은 야외 포장은 물론 실험실에서도 감자뿔나방과 배추좀나방을 기생하는데, 산란수와 생존률을 기준으로하였을 때 기주로서 배추좀나방에 비해서 감자뿔나방을 더 선호하는 것으로 나타났다. 더구나 DfIV는 기생 후 배추좀나방보다 감자뿔나방에서 유전자의 발현이 높은데, 특히 기생 초기에 매우 높았다. 또한 많은 수의 DfIV 유전자가 감자뿔나방에서 주로 발현되었으며, 이러한 유전자들은 두 나비목 기주에서 서로 다른 발현 양상을 보였다. 이 DfIV 유전체 발현의 가소성은 나비목 기주의 종과 기생 후 시간 경과에 따라 나타났다. 또한 이러한 DfIV 유전체 가소성은 그들의 기생봉의 생존률을 높였다. 이것은 PDV와 기생봉간의 공생과 공진화의 증거이며, 새롭게 발견된 DfIV 유전자들은 다양한 연구 분야에 활용이 가능 할 것이다.Parasitoids are found in several insect orders. Among them, Hymenopteran parasitoids are most common paticually Ichneumonoidea. Ichneumonoidea is one of the largest superfamily in Hymenoptera and has four families containing over 60,077 species. The rich species abundance may be achieved with accompanying symbiotic parasitic factors including symbiotic virus, polydnavirus (PDV). PDV belonging to Polydnaviridae and is classified into two groups based on their parasitoid host, Bracovirus (BV)Braconidae and Ichnovirus (IV)Ichneumonidae. This study reports a novel PDV from an endoparasitoid wasp, Diadegma fenestrale (Hymenoptera: Ichneumonidae: Campopleginae). The viral particles were detected in female reproductive organ and showed the typical IV morphology of double membrane structure and segmented genome. This virus was named as D. fenestrale ichnovirus (DfIV). A total of 65 discrete genome segments were separated from the viral DNA extract, and the entire DfIV genome (247,191 bp) was subsequently sequenced and annotated. Among the 65 segments, 62 segments showed a high similarity to Hyposoter fugitivus ichnovirus (HfIV) as determined by BLAST analysis. The average GC contents of DfIV genome was 43.3%. A total of 99 open reading frames (ORFs) were predicted as follows: 40 ORFs of repeat element protein (rep), 12 ORFs of cysteine motif protein (cys motif), 8 ORFs of viral ankyrin (vankyrin), 6 ORFs of viral innexin (vinnexin), 2 ORFs of polar residue-rich, 1 ORF of N gene and 30 ORFs of other unassigned genes. The potato tuber moth (PTM, Phthorimaea operculella, Lepidoptera: Gelechiidae) and the diamondback moth (DBM, Plutella xylostella, Lepidoptera: Plutellidae) were parasitized by D. fenestrale. Nevertheless, based on the oviposition and survival rate, it appeared that D. fenestrale prefers PTM to DBM as hosts. Moreover, DfIV genes were more widely expressed in PTM than DBM after parasitized by D. fenestrale, particularly within a day after parasitized. These initial responses were very important to determine the success or fail of parasitism. In addition, a large number of DfIV genes were expressed only in PTM and these genes exhibited differential expression patterns in two lepidopteran hosts. This finding suggests that the DfIV genome expression plasticity depends on the lepidopteran host species and post parasitization time lapse, perhaps contributing to the enhancement of the parasitoid survival rate. Such host-specific DfIV gene expression may play a crucial role in shaping the symbiotic and coevolutionary relationship between the PDV and the parasitoid. These newly identified DfIV genes could be apply for various research fieds.Abstract ⅰ Contents ⅳ List of Tables ⅶ List of Figures ⅷ Introduction 1 Literature Review 3 ChapterⅠ. Characterization of Diadegma fenestrale Ichnovirus (DfIV) 8 Abstract 9 1. Introduction 10 2. Materials and Methods 11 2.1 Insects 11 2.1.1 Parasitoid 11 2.1.2 Lepidopteran hosts 11 2.2 Characterization of Diadegma fenestrale Ichnovirus (DfIV) 11 2.2.1 Morphological characterization of DfIV 11 2.2.2 DfIV genomic DNA extraction 12 2.2.3 DfIV genome sequencing 13 3. Results 17 3.1 Morphological characterization of DfIV 17 3.2 DfIV genome annotation 22 3.3 Phylogenetic analysis of DfIV genes 30 4. Discussions 40 ChapterⅡ. Comparison of DfIV Gene Expression Patterns in Two Lepidopteran Hosts 42 Abstract 43 1. Introduction 44 2. Materials and Methods 46 2.1 Insects 46 2.1.1 Parasitoid 46 2.1.2 Lepidopteran hosts 46 2.2 Developmental characteristics of D. fenestrale in two lepidopteran hosts 48 2.2.1 Comparison of D. fenestrale developmental period in two lepidopteran hosts 48 2.2.2 Morphological characteristics of D. fenestrale 48 2.2.3 Host preference of D. fenestrale 49 2.3 Transcriptional profile comparison of DfIV genes from lepidopteran hosts 50 2.3.1 Deep sequencing-based transcriptome analysis of DfIV genes from lepidopteran hosts and hosts genes 50 2.3.2 qrtPCR-based gene expression analysis of DfIV genes 51 3. Results 55 3.1 Developmental characteristics of D. fenestrale in two lepidopteran hosts 55 3.1.1 Comparison of D. fenestrale developmental period in two lepidopteran hosts 55 3.1.2 Morphological characteristics of D. fenestrale 57 3.2 Transcriptional profile comparison of DfIV genes from lepidopteran hosts 59 3.2.1 Deep sequencing-based transcriptome analysis of DfIV genes from lepidopteran hosts 59 3.2.2 qrtPCR-based gene expression analysis of DfIV genes 67 4. Discussions 74 Conclusion 77 Literature cited 78 Supplymentary data 88 Abstract in Korean 101 Acknowledgement 103Docto

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백혈병 세포주를 이종이식한 마우스와 랫드 모델에서 CD19 Chimeric Antigen Receptor T 세포의 유효성과 독성 비교 연구

학위논문(박사) -- 서울대학교대학원 : 의과대학 의학과, 2024. 2. 강병철.Comparative Study on Therapeutic Efficacy and Toxicity of CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells in Leukemia Xenograft Mouse and Rat Models Joo-Il Kim Translational Medicine Major The Graduate School Seoul National University Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells have demonstrated outstanding achievements in cancer treatment. Specifically, CD19 CAR-T cells have shown a promising efficacy against relapsed/refractory B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). However, preclinical evaluation of CAR-T cells in relevant animal models is insufficient to assess their therapeutic efficacy. This study evaluated preclinical efficacy, kinetics, and toxicity of CD19 CAR-T cells using NALM6 (human acute lymphoblastic leukemia cell line) xenograft mice and rat models. Both low-dose and high-dose of CD19 CAR-T cells demonstrated significant anti-leukemic efficacy in mice, whereas in rats, efficacy was observed only in the high-dose, which was speculated to be due to the difference in transduction efficiency of CAR-T cells. N Notably, mice displayed peak levels of CD19 CAR-T cells in peripheral blood at day 60 in males and day 30 in females, while rats reached peak levels of CD19 CAR-T cells at week 3 and then excreted them. Importantly, groups receiving CD19 CAR-T cells showed no mortality or clinical changes in mice or rats. These results indicate that 4.0 × 106 cells/mouse and 2.0 × 108 cells/kg of CD19 CAR-T cells were effective in B-ALL xenograft mice and rats, respectively. Therefore, the low-observed effect level (LOEL) of CD19 CAR-T cell is 4.0 × 106 cells/head of mouse and 2.0 × 108 cells/kg of rat. In addition, the no-observed-adverse-effect level (NOAEL) is higher than in both species. This was the first they that successfully established a xenograft leukemia rat model and utilized it for evaluating the efficacy, kinetics, and toxicity of CD19 CAR-T cells. Furthermore, comparative analysis showed differences between the two species, emphasizing advantages of using rats. These findings highlight the availability of cancer models in preclinical evaluation of CAR-T cells and anti-cancer drugs. They also offer valuable insights into their clinical applications. Keywords: Leukemia xenograft rat model; Leukemia xenograft mouse model; CD19 CAR-T cells; efficacy and toxicity assessment Student Number: 2017-26409키메라 항원 수용체 T (CAR-T) 세포는 재발/불응성 B-세포 급성 림프모구성 백혈병 (B-ALL) 치료에서 탁월한 치료효과를 보여왔다. 하지만 CAR-T 세포의 임상 적용 전 유효성과 안전성을 평가하기 위한 적절한 전임상 동물 모델은 현재까지 충분하지 않은 실정이다. 본 연구에서는 NALM6 (사람 유래 급성 림프모구성 백혈병 세포주) 이종이식 마우스와 랫드 모델을 사용하여 CD19 CAR-T 세포의 유효성, 약동학 및 독성을 평가하였다. 저용량과 고용량의 CD19 CAR-T 세포가 투여된 모두 마우스에서 유의한 항백혈병 효과를 관찰하였으나, 랫드에서는 고용량에서만 효과가 관찰되었으며, 이는 CAR-T 세포의 형질 도입 효율의 차이로 인한 결과로 판단하였다. 특히, 마우스에서는 수컷이 60일, 암컷이 30일에 말초혈액에서 가장 높은 혈중 농도를 보여주었으나, 랫드에서는 21일차에 가장 높은 농도를 보여주었다. 이 결과들은 4.0 × 106 세포/마우스 및 2.0 × 108 세포/kg의 CD19 CAR-T 세포가 각각 B-ALL 이종이식 마우스와 랫드에서 효과가 있다는 것을 보였고 이 농도를 LOEL로 판단하였다. 또한, 이 실험 조건 하에서는 NOAEL은 더 높을 것이라고 추정되었다. 본 연구는 최초로 이종이식 백혈병 설치류 모델을 수립하고 이를 통해 CD19 CAR-T 세포의 유효성, 약동학 및 독성을 평가하는데 활용되었다. 또한, 비교 분석은 두 종 간의 차이를 보여주었으며, 랫드의 장점을 강조하였다. 이러한 결과는 종양 질환 모델 마우스와 랫드의 활용성을 제시하며, CAR-T 세포 및 항암제의 사전 임상 평가에 가치 있는 기초자료를 제공한다.ABSTRACT i CONTENTS iii LITERATURE REVIEW iv CHAPTER I . v CHAPTER II vii DISCUSSION AND CONCLUSION ix LIST OF TALBLES x LIST OF FIGURES xii LIST OF ABBREVIATION xiv REFERENCES . 115 국문초록 132박

The Effect of core competence on comparative advance in the small & medium enterprises(SMEs) of Korean autoparts industry

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Thesis(master`s)--서울대학교 대학원 :농생명공학부,2006.Maste