鲫鳍细胞的原、传代培养与水生动物细胞对蛙病毒敏感性的分析

细胞培养目前仍然是病毒学研究基本和必备的方法。水生动物细胞可用于病毒的分离、鉴定、敏感性测定、抗病毒药物筛选和病毒基因功能分析。因此，本文针对鲫鳍细胞原代、传代培养及冻存；不同病毒对水生动物细胞敏感性的分析等进行研究。主要研究内容如下：1. 鲫鳍细胞的原、传代培养。对鲫鳍条组织进行原代、传代培养。第7天就有鲫鳍细胞从组织块附近迁出并贴于细胞培养瓶的壁上，自2016年4月到目前为止，鲫鳍细胞已传代60代以上，原始的单层细胞在一个月后形成，形态不均一。20代后，传代的鲫鳍细胞呈上皮状，第3天可形成单层细胞。其最适生长条件为含10%血清的M199培养基于25 ℃ 条件下培养。2. 水生动物细胞对蛙病毒敏感性的分析。利用3个不同物种的水生动物细胞系，包括爪蟾肾细胞（Xenopus kidney cell line, A6）、大鲵胸腺细胞系（Chinese giant salamander thymus cell line, GSTC）和鲤鱼上皮瘤细胞系（Epithelioma papulosum cyprini cell line, EPC），分别对沼泽绿牛蛙蛙病毒（Rana grylio virus, RGV）和大鲵蛙病毒（Andriasda davidianus ranavirus, ADRV）的感染结果，包括细胞病变显微形态、病毒滴度、细胞病变与不同感染时间的相关性等。显示，在光镜下可见感染病毒的细胞发生病变，A6 和 EPC 细胞肿胀或破裂；GSTC 细胞收缩或聚在一起形成多层。结果还显示同种水产动物细胞系对不同蛙病毒的敏感性不同，在A6, EPC 和 GSTC细胞中，RGV的滴度分别为103.6、105.9 和 106.6 TCID50/mL；ADRV的滴度分别为104.3、105.4 和106.1 TCID50/mL，表明GSTC细胞系对两种蛙病毒都更敏感。研究为后续蛙病毒致病机理提供有用的信息和重要实验材料。3. 重组蛙病毒Δ12L-ADRV的构建。通过荧光标签共进行十一轮挑斑筛选，获得将ADRV 12L替换为p50-EGFP的重组蛙病毒Δ12L-ADRV。一步生长曲线结果表明野生型和重组病毒的滴度在感染后24小时无明显差异；而在36-48小时重组病毒滴度显著低于野生型，空斑实验显示重组病毒形成空斑变小

三种水生动物细胞系对两株蛙病毒敏感性的比较

利用3个不同物种的水生动物细胞系,包括爪蟾肾细胞系(A6)、大鲵胸腺细胞系(GSTC)和鲤上皮瘤细胞系(EPC),分别用沼泽绿牛蛙蛙病毒(RGV)和大鲵蛙病毒(ADRV)感染,进一步研究细胞病变显微形态、病毒滴度、细胞病变与不同感染时间的相关性等。结果显示,在光镜下可见感染病毒的细胞发生病变,A6和EPC细胞肿胀或破裂;GSTC细胞收缩或聚在一起形成多层。同种水产动物细胞系对不同蛙病毒的敏感性不同,在A6、EPC和GSTC细胞中,RGV的滴度分别为10~(3.6)、10~(5.9)和10~(6.6) TCID_(50)/m L;ADRV的滴度分别为10~(4.3)、10~(5.4)和10~(6.1) TCID_(50)/m L,表明GSTC细胞系对两种蛙病毒都更敏感。研究为后续蛙病毒致病机理提供了有用的信息和重要实验材料