A superior drug carrier – aponeocarzinostatin in partially unfolded state fully protects the labile antitumor enediyne

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Neocarzinostatin is a potent antitumor drug consisting of an enediyne chromophore and a protein carrier.</p> <p>Methods</p> <p>We characterized an intermediate in the equilibrium unfolding pathway of aponeocarzinostatin, using a variety of biophysical techniques including 1-anilino-8-napthalene sulfonate binding studies, size-exclusion fast protein liquid chromatography, intrinsic tryptophan fluorescence, circular dichroism, and ¹H-¹⁵N heteronuclear single quantum coherence spectroscopy.</p> <p>Results</p> <p>The partially unfolded protein is in molten globule-like state, in which ~60% and ~20% tertiary and secondary structure is disrupted respectively. Despite lacking a fully coordinated tertiary structure for assembling a functional binding cleft, the protein in molten globule-like state is still able to fully protect the labile chromophore. Titration of chromophore leads the partially denatured apoprotein to fold into its native state.</p> <p>Conclusion</p> <p>These findings bring insight into conserving mechanism of neocarzinostatin under harsh environment, where even the partially denatured apoprotein exhibits protective effect, confirming the superiority of the drug carrier.</p

細胞環境中藥物的釋放 ---生色團蛋白抗生素的運作

自五零年代開始，多種生色團蛋白抗生素被陸續發現，但很多連結構都不清楚，至目前止，大家只對烯雙炔生色團蛋白抗生素有比較清楚的認知。烯雙炔抗生素是目前所知最強烈的抗腫瘤藥物群之一，其新奇化學結構，神奇作用機理，以及強烈的生物活性，是目前國際上相當受重視的研究項目之一。十元環烯雙炔抗腫瘤抗生素比較穩定，能夠獨自存在，但大部分的九元環烯雙炔，如新抑癌素、可導素錠、C-1027 等，由於高度不穩，需要結合特定的蛋白，蛋白雖無生物活性，但能攜帶與保護生色團，並適當的釋放出烯雙炔藥物，從而破壞核酸，導致細胞死亡。生色團如何破壞核酸已相當清楚，但蛋白如何在細胞環境下攜帶、並釋放生色團，所知甚少。我們認為只有清楚認識蛋白在細胞環境下對生色團的操控等作用機理，才能對這種強烈的抗腫瘤抗生素有更好的臨床應用。新抑癌素在水中釋放生色團的速率相當緩慢，我們懷疑這樣緩慢的藥物釋放似乎對細胞難以造成有效攻擊，因此細胞之中應該有未被發現的刺激物，該化合物可刺激攜帶蛋白，因而觸發藥物的釋放。我們設計的方法包括：(一)用仿生化學物質，探測細胞物質如細胞膜等，作為釋放藥物的刺激物的可能性；(二)利用帶有螢光的化學物質，標記烯雙炔生色團蛋白，用酵母細胞作模型，利用目前發展成熟的螢光映像技術，觀察抗生素藥物在細胞中的運送及釋放等的運作機理。我們預期能從設計的實驗中，獲得更多烯雙炔生色團蛋白在細胞中的作用。這是我們提出的全新計畫，需要準備操作的步驟很多，因此希望能得到五年的支持

Exploring Folding and Unfolding of Enediyne Antitumor Antibiotics through Protein Engineering

蛋白摺疊與開散的研究目前屬於生物化學中的一個重要領域。近年新發現環式烯雙炔結構的天然抗腫瘤抗生素，是目前所知最強烈的抗腫瘤藥物群之一，具有破壞去氧核醣核酸的能力。其新奇化學結構，奧妙作用機理，以及強烈活性，成為國際上受重視的研究項目之一。大部分九元環烯雙炔並不穩定，需要蛋白的保護及攜帶，研究生色團蛋白的摺疊與開散，有助於理解烯雙炔類抗生素的作用。在本計劃中，我們企圖運用蛋白工程技術製造並?化定點突變的蛋白，並運用生物物理的技術來探討個別殘基對蛋白維持三度摺疊穩定的影響，包含的方法如下：﹝一﹞用圓二色及螢光光譜儀來檢測摺疊與開散的路徑；﹝二﹞用氫同位素交換技術來偵測摺疊與開散的過程；﹝三﹞用停流光譜等技術來探討摺疊與開散的速率；﹝四﹞用多維核磁共振光譜儀來瞭解蛋白的動態構型。運用以上的方法，可以提供蛋白摺疊結構的性質，這些基礎知識應對該藥物的臨床運用有相當幫助。蛋白摺疊是屬於長期的研究工作，也是目前的國際焦點之一。本計畫是延續性計畫，在現有成果的基礎下，我們將進一步探討個別殘基的影響力。烯雙炔抗生素是鏈黴菌的產物，我們已克服許多困難，成功製備表達系統，能夠得到與原型蛋白頭尾順序完全一致的蛋白，也已有能力經由蛋白工程技術得到需要的變種，由於變種蛋白的製備，頗耗時日，因此我們申請連續五年的支持，我們會善加利用退休之前的時日，努力研究，希望對蛋白的性質能有更完善的瞭解