Screening for plant-growth promoting traits and the inoculation effect on plants of Azospirillum rugosum sp. nov. and salt-tolerant rhizosphere bacteria

土壤中有益的游離生活細菌常與植物根結合，稱為「植物生長促進根圈細菌」（PGPR）。PGPR 與植物作用的機制包含生物肥料、生物防治、植物刺激及生物復育等。為了篩選可促進作物生長之有益微生物，本研究自台灣土壤及含鹽地多種植物的根圈土壤中分離本土微生物、鑑定並針對多種植物生長促進(PGP)的特徵進行一系列之研究。本研究自台灣台中縣市、嘉義縣、南投縣、霧峰鄉、高雄縣等地區的土體樣品中分離54株細菌，其中IMMIB AFH-6 菌株為高雄縣油煉廠油汙汙染的土壤的分離菌，經16S rDNA 序列分析比對結果與 Azospirillum canadense 標準菌株最相似 (96.8%)，與Azospirillum 其他標準菌株的相似度均低於97%；染色體DNA-DNA 雜合顯示IMMIB AFH-6 與A. brasilense、 A. canadense 和 Azospirillum doeberinerae 的標準菌株關連性為25%、17%及19%。菌體脂肪酸組成中主要的非羥基脂肪酸為n-C18:1ω7c(39.61%)、羥基脂肪酸為n-C14:0 3-OH（5.6%），基於化學分類、表現型、親緣型的多相分類的證據，IMMIB AFH-6 菌株為新種命名為Azospirillum rugosum。目前已有許多關於Azospirillum刺激植物生長發育的研究資料，但對於其與植物結合過程的機制仍不甚了解，因此本研究選擇屬於Azospirillum 的IMMIB AFH-6進行此菌株之植物生長促進特徵之研究，並探討微生物接種配合化學肥料及有機質肥料，對作物生長之影響。IMMIB AFH-6 菌株具有游離固氮、磷酸三鈣溶解、吲哚3-乙酸（IAA）生成、硝酸還原酶、磷酸水解酶等促進作物生長之特徵，產生胞外多醣體，有利於根拓殖化作用，種子發芽生物分析接種IMMIB-AFH6，可促幼苗胚根生長44%（萵苣）及52%（小蘿蔔），促進胚莖長度27%(萵苣)及24%(小蘿蔔)。萵苣盆栽試驗結果顯示，接種IMMIB AFH-6 菌株並施用半量化肥(NPK)及猪糞有機肥(PMF)，對於地上部的生質量有明顯促進之效益，除產量可明顯提高58.3%外，植體中之N、P、K、Zn 的相對養分吸收率亦顯著提高，分別達200%、138%、162%及237%。 含鹽地12 種植物根圈土壤中分離出63 個菌株，並測試其固氮、溶解磷酸鈣、產生IAA、1-胺基環丙烷-1-羧酸（ACC）去胺酶、胞外多醣（EPS）的能力。以微鹽分範圍0.13%氯化鈉濃度，大油菜的胚根與胚莖具有最大的生長長度，0.88%氯化鈉濃度下則胚根與胚莖均受到抑制（28%），本研究選擇20株具植物生長促進特徵的耐鹽性分離菌株及6株耐鹽性的Azospirillum標準菌株，測試其在0.13%及0.88%鹽度下接種對於大油菜種子發芽生長2週的影響。結果顯示在0.13%鹽濃度下，接種不具生產植物激素IAA能力的菌株包括Bacillus sp. CC-CCM15-5、Brachybacterium sp. CC-LVL15-1 及Shinella sp. CC-CCM15-2菌株，對植物生長有抑制的作用，但在0.88%鹽濃度則接種反而有顯著促進生長（分別提高胚莖長度278%、132%、287%，提高胚根長度64%、150%、101%）的效果。另接種具產生IAA 能力的3菌株Arthrobacter sp. CC-HBB15-2、Brevibacterium CC-SN15-10、Staphylococcus sp. CC-SN15-6 在0.88%鹽濃度下卻有抑制大油菜的生長（胚莖長度被抑制26%、24%及35%；胚根長度被抑制12、17%及10%）的效果，其他植物生長促進相關特徵如固氮、溶磷酸鈣、ACC 去胺酶活性、產生乙烯能力與菌株在0.88%鹽度下促進幼苗生長無必然相關。此結果暗示：特別是在鹽逆境下包含乙烯抑制主根生長，及誘導側根與不定根生長，其合成受到相對高量的IAA所誘導的已知機制應加以考慮。Beneficial free-living bacteria in soil are usually associated with root of plant, mentioned as plant-growth promoting rhizobacteria (PGPR).。Mechanisms in the action of PGPR on plant were classified into biofertilization, biological control, phytostimulation, bioremediation, etc. In order to screen beneficial bacteria which show the promotion to plant growth, the indigenous strains from bulk soil and salinated rhizosphere samples were isolated, identified and characterized with multiple plant growth promoting (PGP) traits. The 54 isolates were from bulk soil of Taichung County, Chiayi county, Nantou county, Wufong County and Kaushiung County in Taiwan; among them the strain IMMIB AFH-6 was isolated from refinery oil contaminated soil, and highest similarity (96.8%) was shown to type strain of Azospirillum canadense based on 16S rDNA sequence. The similarity level are lower than 97% to other type strain of Azospirillum; chromosomal DNA-DNA pairing study showed that IMMIB AFH-6 displayed 25%, 17% and 19% relatedness to the type strain of A. brasilense, A. canadense and A. doeberinerae. Major non-hydroxylated fatty acids are n-C18:1ω7c(39.61%) and the major hydroxylated fatty acid are n-C14:0 3-OH (5.6%). Based on chemotaxonomic, phenotypic and phylogenic evidences, isolate IMMIB AFH-6 are proposed as novel species and named A. rugosum. A lot of experimental data about stimulation of plant growth and development by Azospirillum, but the mechanisms during association is not realized. The PGP traits of Azospirillum rugosum IMMIB AFH-6 and the effects of inoculation with IMMIB AFH-6 combined with fertilizer and organic fertilizer on crop growth was studied. IMMIB AFH-6 has free-living dinitrogen fixation, tricalcium phosphate solubilization, indole-3-acetic acid (IAA) production, nitrate reductase, phosphatase activities and can produce exo-polysaccharide to colonize root and promote plant growth. Inoculation with IMMIB-AFH6 can improve radicle length by 44%（lettuce） and 52%（radish）; hypocotyl length by 27% (lettuce) and 24% (radish) under seed germination assay. Hence, we select IMMIB AFH-6 belong to genus Azospirillum to study about PGPR. An integrated strategy was used to promote plant growth by a combination of bacterial inoculation, mineral fertilizer and organic fertilizer application. The results demonstrated that shoot biomass (yield) was increased by 58% and the relative nutrient absorption rate (200%、138%、162%、237%) of N, P, K, Zn in shoot also apparently increased after application of Azpspirillum rugosum IMMIB AFH-6 in combination with half-dose of mineral fertilizer and pig manure organic fertilizer (PMF). Sixty three bacterial strains were isolated from salinated rhizospheres of twelve plants. The bacterial ability of nitrogen-fixation, tricalcium phosphate solubilization, IAA production, 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) deaminase and extracellular polysaccharide (EPS) production were measured individually. Canola seed germination bioassay introduced in 0-0.88% saline water and best growth in 0.13% sodium chloride are shown and growth was inhibited by 28% in 0.88% sodium chloride. Twenty strains with plant-growth promoting traits among isolates from salinated rhizosphere was chosed as bioinoculants to tested canola growth in 0.13% and 0.88% sodium chloride during 2 weeks. And the results demonstrated that growth of seeds inoculated with IAA-producing bacteria involved Bacillus sp. CC-CCM15-5, Brachybacterium sp. CC-LVL15-1 and Shinella sp. CC-CCM15-2 were inhibited in 0.13% sodium chloride by 75%, 69% and 72% in hypocotyl and 60%, 36% and 51% in radicle respectively, but was improved, by 278%, 132% and 287% in hypocotyl and by 64%, 150% and 101% in radicle respectively, in 0.88% sodium chloride. While the growth of seeds inoculated with IAA producing strains Arthrobacter sp. CC-HBB15-2, Brevibacterium CC-SN15-10 and Staphylococcus sp. CC-SN15-6 were inhibited by 26%, 24% and 35% in hypocotyl and 12, 17% and 10% in radicle under 0.88% sodium chloride. The other PGP traits including nitrogen fixation, tricalcium phosphate solubilization, ACC deaminase, and ethylene production seems not shown indispensable for bacteria to improve seedling growth in 0.88% sodium chloride in this research. This result impliedthat known mechanism including inhibition of primary root growth, and induction of lateral and adventious root growth by ethylene and synthesis of which induced by relatively high concentration IAA should be considered especially in salt stress.目錄: 摘要 I Abstract III 目錄 V 表次 VШ 圖次 Х 壹、前言 1 貳、前人研究 3 一、 植物根圈的介 3 （一） 植物根圈的定義 3 （二） 植物根圈的結構 3 二、根圈微生物與植物的交互作用 3 （一） 植物對根圈微生物的作用 3 （二） 微生物對於植物的效應 5 三、「根圈細菌」的分類及其定義 5 （一） 根圈細菌（RB） 5 （二） 植物生長促進根圈細菌（PGPR） 6 （三） 細胞內PGPR與細胞外PGPR 6 （四） 有害的根圈細菌(DRB) 6 四、根圈細菌的主要族群種類 6 （一） PGPR的族群 6 （二） DRB的族群種類 7 （三） DRB與PGPR的分類 8 五、根圈細菌的作用機制 8 （一）微生物的根拓殖作用 8 （二） PGPR的作用機制的探討 10 （三） DRB對植物的作用 12 （四）PGPR、DRB與植物根細胞之間的作用機制 13 六、研究根拓殖化細菌方法學的探討 15 （一） 根拓殖化細菌的能力分析 15 （二） 根圈微生物群落的分析方法17 （三） 以分子生物技術研究環境微生物的方法19 參、材料與方法 21 一 、細菌菌株的分離與培養 22 （一） 環境細菌分離來源 22 （二） 土壤及根圈懸浮液的製備 22 （三） 細菌的分離、純化與保存 23 二、分離細菌菌株的鑑定 24 （一）細菌分子生物學的鑑定 24 （二）細菌化學分類學鑑定 28 （三）菌體培養及形態觀察 30 （四）菌體生化與生理性質分析31 三、細菌與促進植物生長有關的分析 39 （一）產生載鐵物質的測試 39 （二）游離生活生物固氮活性分析 40 （三）無機磷酸鹽溶解測試 42 （四）產生IAA類似物質的分析 43 （五） ACC脫胺酶活性分析 44 （六）細菌產生乙烯能力的分析 45 （七）細菌產生胞外多醣的分析 46 四、細菌接種對植物生長的影響 47 （一）種子發芽生物分析 47 （二） 溫室盆栽試驗 48 五、試驗設計及統計分析 57 肆、結果與討論 58 一、土體中可培養細菌的分離與鑑定 58 二、土體分離細菌IMMIB AFH-6菌株分類地位的研究 64 （一） IMMIB AFH-6的分離與培養 64 （二） IMMIB AFH-6 菌株的分子分類學的研究 64 （三） IMMIB AFH-6菌株之化學分類學研究 67 （四） IMMIB AFH-6 菌株的培養特性及型態分析 70 （五） IMMIB AFH-6 菌株的命名與寄存 72 三、 Azospirillum rugosum IMMIB AFH-6促進植物生長的研究 75 （一） A. rugosum IMMIB AFH-6菌株於植物體外的PGP特性 75 （二） A. rugosum IMMIB AFH-6菌株利用（氧化）不同碳源的能力79 （三） A. rugosum IMMIB AFH-6菌株對抗生素的敏感性 80 （四）對植物生長的影響 83 四、自含鹽分地植物根圈細菌的分離與鑑定 92 五、在含鹽分條件下之根圈細菌的功能研究 102 （一） 含鹽分地根圈分離菌株的IAA 產生能力 102 （二） 含鹽分地根圈分離菌株的ACC 去胺酶活性102 （三） 含鹽分地根圈分離菌株的產生乙烯能力 106 （四） 含鹽分地根圈分離菌株的產生胞外多醣的能力 107 六、含鹽分土壤中植物根圈土壤分離細菌接種 111 （一）不同鹽度下油菜種子的發芽的生物分析 111 （二） 種耐鹽細菌的選擇接及其酵素活性類型的特性 113 （三） 鹽濃度下接種細菌對於大油菜種子發芽生長的影響 114 （四）具促進植物生長潛力的耐鹽細菌菌株在不同鹽度對適應pH之生長範圍 121 （五） 具促進植物生長潛能的耐鹽細菌菌株的碳源利用能力124 伍、結論 126 陸、參考文獻127 柒、附錄14

Production and characterization of the protease from Bacillus sp. P-6.

A protease producing bacterium was isolated and identified as Bacillus sp. strain P-6. The optimal condition for protease production was found, when the culture was shaken at 37℃ with 100 rpm for 30 hours in 250 ml Hinton flask containing 50 ml of medium consisted of 0.5 % disodium succinate ( 6 H2O ) , 0.2 % casamino acid, 0.2 % yeast extract, 0.14 % NaH2PO4, 0.44 % K2HPO4, 0.01 % CaCl2 and 0.02 % MgSO4. Under such conditions, protease activity of 342 U/ml was attained. The protease was purified through ultrafiltration, ammonium sulfate fractionation, CM-Sepharose CL-6B ionic exchange chromatography, and Sephacryl S-200 gel filtration. A 9-fold purification of the enzyme over crude enzyme preparation and specific activity of 8066 U/mg was shown. And the recovery of activity was 14 %. The molecular weight of the enzyme was determined to be 35 kDa by SDS-PAGE. The N-terminal amino acid sequence of this protease is VTGTN(Y/V)VGTGIG , and showed a high degree of homology with other neutral proteases belonging to thermolysin superfamily . The protease was found to have a pH optimum at 7.0, a temperature optimum at 60℃ as acting on casein. The protease was stable at ~55℃and pH 8.0-10.0. Among several natural substrates determined, casein was the best substrate. Limited substrate specificity of the protease was observed while the product of casein digested by the protease was analysed with SDS-PAGE.The activity of protease was strongly inhibited by EDTA. The EDTA-inhibited protease was partial reactivated by Co2+, Ca2+, Mg2+, Fe+2.篩選具蛋白酉每生產能力的菌株，經初步鑑定並命名該菌株為Bacillus sp. P-6。其最適生產條件為: 以250 ml Hinton錐形瓶盛裝50 ml 含有0.5 % 琥珀酸二鈉(含六分子水)、0.2 % Casamino acid、0.2 %酵母抽出物、0.14 % 磷酸二氫鈉、0.44 % 磷酸氫二鉀、0.01 %氯化鈣和0.02 % 硫酸鎂的培養基，於37℃ 100 rpm下，恆溫振盪培養30小時，可得較高蛋白酉每活性( 342 U/ml )的粗酵素液。 將粗酵素液經超過濾濃縮、硫酸銨區分、CM-Sepharose CL-6B陽離子交換層析及Sephacryl S-200膠體過濾層析，得到比活性為8066 U/mg的蛋白酉每，其純化倍數為9倍，而回收率為14 %。以SDS-PAGE測得此蛋白酉每的分子量為35 kDa。分析蛋白酉每之N-端月安基酸序列為VTGTN(Y/V)VGTGIG，顯示此蛋白酉每與熱溶酉每超家系的中性金屬蛋白酉每同源性較高。 此蛋白酉每的最適溫度為60℃，最適pH為7.0，對於蛋白質的水解以酪蛋白的活性最高。在55℃以下以及pH 8.0-10.0之間均可維持較高安定性。分析蛋白酉每催化之酪蛋白水解產物，推測此蛋白酉每具有限制性的基質專一性。蛋白酉每活性受到EDTA強烈的抑制作用。添加Co2+、Ca2+、Mg2+和Fe2+ 於EDTA抑制的蛋白則有部份復活化之效果。目 錄 頁數 中文摘要--------------------------------------------------------- 1 英文摘要--------------------------------------------------------- 2 第一章 前言----------------------------------------------------- 3 一、蛋白酉每簡介-------------------------------------------- 3 二、蛋白酉每的分類依據與其命名---------------------- 4 三、蛋白酉每的一般性質----------------------------------- 7 四、蛋白酉每的作用機制---------------------------------- 10 五、蛋白酉每在工業上的應用---------------------------- 17 六、蛋白酉每的展望與本研究的目的------------------ 20 第二章 材料與器材-------------------------------------------- 22 一、 菌株-------------------------------------------------------- 22 二、 酵素-------------------------------------------------------- 22 三、 藥品-------------------------------------------------------- 22 四、 儀器與設備---------------------------------------------- 23 第三章 實驗方法----------------------------------------------- 27 一、 菌種的篩選與鑑定------------------------------------- 27 1、 分離菌之初步確認--------------------------------------- 27 2、 二次篩選---------------------------------------------------- 27 3、 分離菌株的純化與鑑定--------------------------------- 27 二、 蛋白酉每生產條件的探討---------------------------- 28 1、 不同生產培養基的研究--------------------------------- 28 2、 最適培養條件的研究------------------------------------ 28 3、 最適培養基組成的研究--------------------------------- 29 三、 蛋白酉每之生產----------------------------------------- 30 1、 菌株的增殖------------------------------------------------- 30 2、 酵素的生產------------------------------------------------- 30 3、 粗酵素液的製備------------------------------------------- 30 四、 酵素的純化------------------------------------------------ 30 1、超過濾--------------------------------------------------------- 31 2、硫酸銨沉澱--------------------------------------------------- 31 3、陽離子交換層析--------------------------------------------- 31 4、膠體過濾層析------------------------------------------------ 32 五、 酵素生化性質的分析------------------------------------ 32 1、 酵素活性之測定-------------------------------------------- 32 2、 蛋白質濃度測定-------------------------------------------- 33 3、 蛋白質電泳分析--------------------------------------------- 33 4、 蛋白酉每的純度判定--------------------------------------- 33 5、 次單元分子量的分析--------------------------------------- 34 6、 酵素活性染色------------------------------------------------- 35 7、 酵素一般生化特性的測定--------------------------------- 35 8、 天然基質專一性的研究------------------------------------ 37 9、 酪蛋白分解產物的分析------------------------------------ 37 10、 蛋白酉每抑制劑的測定----------------------------------- 38 11、 酵素復活化試驗-------------------------------------------- 38 12、 N端基酸序列分析--------------------------------------- 38 第四章 結果--------------------------------------------------------- 40 一、 菌種的篩選與鑑定----------------------------------------- 40 二、 培養基及生產條件的探討------------------------------- 40 1、 生產培養基---------------------------------------------------- 40 2、 生產條件的影響---------------------------------------------- 46 3、 培養基組成的影響------------------------------------------- 50 三、 酵素純化------------------------------------------------------ 60 四、 酵素生化性質的分析-------------------------------------- 69 1、 次單元分子量的測定--------------------------------------- 69 2、 酵素最適反應溫度------------------------------------------ 69 3、 酵素熱安定性------------------------------------------------ 69 4、 酵素最適pH--------------------------------------------------- 69 5、 酵素pH安定性------------------------------------------------ 72 6、 對天然基質的專一性--------------------------------------- 72 7、 抑制劑對酵素活性的影響--------------------------------- 76 8、 金屬離子對酵素的復活化--------------------------------- 76 9、 酪蛋白之水解產物分析------------------------------------ 79 10、 N端基酸序列的比對------------------------------------ 79 第五章 討論--------------------------------------------------------- 82 一、 蛋白酉每生產菌株的篩選-------------------------------- 83 二、 蛋白酉每的生產條件之探討----------------------------- 83 三、 酵素純化之探討--------------------------------------------- 85 1、 蛋白酉每純化遭到的問題---------------------------------- 85 2、 純化流程的建立----------------------------------------------- 86 四、 酵素的生化性質分析--------------------------------------- 87 1、 蛋白酉每分子量的探討------------------------------------- 87 2、 酵素最初反應活性的探討---------------------------------- 87 3、 酵素安定性的探討------------------------------------------- 88 4、 基質專一性的探討------------------------------------------- 89 5、 活性部位的初步探討---------------------------------------- 89 6、 酵素同源性之探討------------------------------------------- 90 參考文獻------------------------------------------------------------ 92 附錄一-------------------------------------------------------------- 108 附錄二-------------------------------------------------------------- 115 附錄三----------------------------------------------------------------- 11

包含菌體及腐植酸的海藻酸鈣膠囊

本發明為提供一種用於將菌體固定化於微膠囊材料之方法，特別是關於將菌體與腐植酸共同固定化於天然微膠囊材料，例如海藻酸鈣膠囊中之方法。本發明亦關於根據該方法所製得之包含菌體及腐植酸的海藻酸鈣膠囊，以其所製成之微生物肥料或土壤改良劑，及其用以促進植物生長與改善菌體根部拓殖化作用之用途。 【創作特點】 本發明目的及優點將部分描述於下，或可由描述中顯而易見。 於一方面，本發明係關於一種製備菌體微膠囊之方法，該方法包含：將具有植物生長促進功能之菌體先行培養於液體培養基中以增殖菌體；及將該經增殖之菌體與腐植酸萃取物(HA)共同固定化於海藻酸鈣膠囊內，而製得「包含菌體及腐植酸之海藻酸鈣膠囊」。於一項具體態樣中，可將經過或未經乾燥之菌體微膠囊直接施用於作物根圈或土壤中，做為作物之微生物肥料、土壤改良劑或植物生長促進製劑。 本發明所稱之「包含菌體及腐植酸之海藻酸鈣膠囊」，其所包含之「菌體」為具有促進植物生長的活性的特徵者，其中包括如：(1)固氮酶、(2)礦物磷溶解作用、(3)產生吲哚－3－乙酸(indole－3－acetic acid；IAA；auxin)、(4)產生載鐵物質(siderophore)及(5)有機質分解活性。習知這些活性與PGPR的功能有關，包括：生物肥料作用(biofertilization)、植生激素作用(phytostimuiation)、生物防治(biocontrol)等，另外習知有機質的分解與土壤改良相關。將上述功能發揮作用的前提為菌體可於植物根圈(rhizosphere)內進行根拓殖化作用(root colonization)。 於另一方面，依據本發明可製得一種有序性的微生態結構(micro－ecologic structure)，亦即本發明所稱之「包含菌體及腐植酸之海藻酸鈣膠囊」之組成物，其包括菌體、HA萃取物及海藻酸鈣。本發明之「包含菌體及腐植酸之海藻酸鈣膠囊」可另包含其他具有功能之微生物、酶、發酵物或化學物質，以提高此膠囊之促進植物生長作用之功能。另一方面，「包含菌體及腐植酸之海藻酸鈣膠囊」視需要可另包含供培養微生物的培養物或穩定劑，以利微生物之生長繁殖或生理維持。 於一項具體態樣中，本發明提出一種固定化菌體於微膠囊的方法，其包含在海藻酸鹽聚合物之硬化作用尚未啟動前，先將腐植酸萃取液與菌體混合為「HA/菌體懸浮液」；將此「HA/菌體懸浮液」與海藻酸鈉混合，成為一「HA/菌體/海藻酸鈉」混合液，此時之「HA/菌體/海藻酸鈉」混合液尚未行硬化或交聯作用；以及將此一「HA/菌體/海藻酸鈉」混合液逐滴滴入氯化鈣水溶液以進行硬化作用而形成「包含微生物及腐植酸之海藻酸鈣膠囊」。 於另一項具體態樣中，本發明提出一種菌體微膠囊之保存及控制釋放方法，其中係將「包含微生物及腐植酸之海藻酸鈣膠囊」添加少量抗凍劑，經過冷凍乾燥成為乾燥膠囊。此一型態之膠囊施用植物根圈內可因水澎潤作用，使膠囊回復為近未乾燥前的膠囊狀態，以土壤中水份含量之乾燥與潮濕控制膠囊的復性速度，復性後之膠囊可以進行正常之釋放作用。 於另一方面，本發明提出一種促進植物生長作用之方法，其係將本發明「包含菌體及腐植酸的海藻酸鈣膠囊」施用於植物根圈土壤。於一項具體態樣中，將本發明「包含菌體及腐植酸之海藻酸鈣膠囊」施用於土壤、堆肥或含有機質之廢棄物等，可發揮其提高有機質分解、促進堆肥腐熟及土壤改良的目的。 本發明之「含有微生物菌體及腐植酸的海藻酸鈣微膠囊」可用以提供保護微域環境，保護菌體免於受到存於土壤的原生動物與嗜菌體等生物的侵襲、土壤中有害物質的毒害之菌體大量流失。並利用該「含有微生物菌體及腐植酸的海藻酸鈣微膠囊」製成控制釋放的生物製劑，可避免游離菌體施用後根圈內之菌體數量的減少，因此可以提高微生物之根拓殖化(root colonization)效應。 本發明之再一方面在於，係利用「含有菌體及腐植酸的海藻酸鈣微膠囊」以提供菌體掩護作用，可避免游離菌體施用根圈後植物防衛系統之對於菌體之根拓殖化的抑制，並利用防護免疫作用(immuno－protection)的機制，以改善微生物之根拓殖化作用、提高促進植物生長的效益。 依照本發明之具體實施態樣，用以固定化之菌體菌種為；(1)不屬於已知之人體病原菌、(2)非植物病原菌體、(3)未經任何人工基因改造、(4)游離細胞狀態具有植物生長促進功能、(5)菌體被固定化於完整之海藻酸鈣膠囊內可存活的功效者。 本發明的其他特性將在下面詳細揭示具體實施例觀察後變得顯而易見