BaMV Infectious cDNA Construction and the Study of Its Replication

竹嵌紋病毒(Bamboo mosaic virus, BaMV)為一曲形 柱狀植物病毒,含有單一正股(Positive strand)核糖 核酸(RNA).此一病毒除具地域性外,對台灣麻竹 及綠竹造成相當嚴重的危害.因此徹底了解此 病毒的危害機制實為解決此病害的根本之道. 合成及篩選具高度感染性的轉錄體(High infectivity transcripts)是為一切了解病毒在分子生 物學上的首要工具.有了此工具則探討病毒在寄主細胞內基因的表現及其複製時所需要的訊 息.目前在台灣林納生博士及徐堯煇博士已篩 選到一株具有感染性的cDNAclone,然而其感染性 仍然稍低,不利於進一步的研究.本計畫的目的 即是利用一些分子生物學上的技術去探討低感 染性的成因及如何加強其感染性.實驗的內容 包括合成Antisensetranscript與野生型病毒雜配,利 用RNase protection的方式,來探討突變的位置.在完 成高感染性的cDNA clone之後,則可以進一步探討 其3'noncoding region對BaMV複製的重要性.利用電腦 來分析其二級結構再依其結構製造一系列的突 變種來做測試.目前在分子病毒學界(Molecular virology)合成具感染性的cDNA clone都將病毒的核 糖核酸分子合成cDNA後,再接於T7 RNA polymerase promoter之後,然後利用T7 RNA polymerase來製造體外 轉錄體(in vitrotranscripts).由於此酵素的市面價 格昂貴,因此建立純化此一酵素系統是本計畫 的另一目的

The Study of the Relationship between the 3'Noncoding Region of Bamboo Mosaic Virus RNA and Its Replication (I)

經由電腦的模擬計算，我們發現竹嵌紋病毒核酸基因體末端，即3'端會形成三級結構，為了進一步了解這個三級結構與竹嵌紋病毒核酸基因體複製的關係，我們在這個三級結構上製造了一些突變以破壞這個三級結構，由初步的結果發現這個三級結構確實與竹嵌紋病毒核酸基因體複製有關係。然而我們對於這個三級結構的存在只靠電腦的模擬計算，並沒有實質的直接證據。因此在這新的三年的計畫裏，我們將著手探討這個三級結構的存在與其存在的意義。第一年的計畫中，我們將著重於核酸的結構圖譜分析，亦即利用各種核酸分解酵素如RNase T1，RNase T2，RNase A，RNase V1等將病毒核酸予以部份分解來證實這個三級結構存在的可能性。除此之外，我們亦將利用一些modification chemicals進行核酸的修飾，以便和酵素分解圖譜做雙重的確認。第二年及第三年的計畫中，我們將著重於核酸的三級結構圖譜與竹嵌紋病毒核酸基因體複製的關係。亦即在第二年對3'end polyA的長度進行研究﹐我們將製造出一系列不同長度的"As"突變株﹐來探討病毒複製所須要"As"的臨界長度﹐我們亦將探討這個polyA是否也扮演穩定核酸的角色﹐所以將導入tRNA-likestructure的結構以取代polyA來進一步研究其功能。在第三年的計畫中，我們將著重於核酸的三級結構圖譜中3(端的noncoding region 具有一可能會影響RNA複製的hexanucleotidemotif（5'-ACCUAA）。經由核酸序列比對發現，這六個核甘酸序列在所有已發表的potexvirus group病毒和相類似的carlavirus中都是conserved的序列。所以針對這hexanucleotide分別製作六個核甘酸的隨機突變體來找出真正影響複製的核甘酸

豬瘟病毒核酸基因體3'端與寄主蛋白結合的功能探討

豬瘟，又稱豬霍亂，是由豬瘟病毒所引起的一種高度敗血症傳染性疾病，以嚴重的全身性出血為主癥，感染率與死亡率均高達95%，是國際公認的豬隻重要傳染病。兔化豬瘟疫苗屬於馴化活毒疫苗對豬隻即具有高度安全性且具高度免疫力。為了瞭解強毒株(ALD)與弱毒株(LPC)之間的遺傳變異上的關係，我們進行LPC 與ALD 的序列比對，結果發現兩者序列之間的確有些許的差異，這個差異主要位於3′端非轉譯區上，LPC 弱毒株比ALD 強毒株多出了13 個核.酸 (CUUUUUUCUUUUU) ，這多出的序列是否可能就是兩者之間主要的差異點將成為整個計劃的主軸。由先導試驗得知，這個只在LPC3′UTR 出現的序列位於SLIII 的loop 區域，而且經由UV-crosslinking 與immuno-precipitation 的實驗得知有至少六個蛋白質能與3′UTR 進行結合，而其中polypyrimidine-tract binding protein 則可能只針對LPC 這段多出來的序列進行專一性的連結。為探求這段序列及這些與3′UTR 結合蛋白質的功能，我們將以in vitro translation的系統來證實這些蛋白質與3′UTR 所結合的可能性功能，並同時建立in vivo translation的系統，其中將以luciferase gene 來取代部份豬瘟的轉譯序列並觀察luciferase gene 的表現。我們也將在第二年計畫中建立一個在細胞中可以偵測複製效率(replicon)的系統。同時將用Heparin-Sepharose column 與Q-column 來分離與純化這些蛋白質，並將些個蛋白質以LC/MS/MS 來定序。最後在第三年的計畫中將以replicon 為基礎，建構一系列在3′UTR 的突變株，證實那些核酸片段及序列具有與複製相關的cis-acting elements