Cloning of the gene and characterization of the enzymatic properties of the monomeric alkaline phosphatase (PhoX) from Pasteurella multocida strain X-73

We have identified a new phoX gene encoding the monomeric alkaline phosphatase from Pasteurella multocida X-73. This gene was not found in the published genome sequence of Pasteurella multocida pm70. Characterization of the recombinant PhoX of Pasteurella multocida X-73 showed that it is a monomeric enzyme, activated by Ca2+ and possibly secreted by the Tat pathway. These features distinguish phosphatases of the PhoX family from those of the PhoA family. All proteins of the PhoX family were found to contain a conserved motif that shares significant sequence homology with the calcium-binding site of a phosphotriesterase known as diisopropylfluorophosphatase. Site-directed mutagenesis revealed that D527 of PhoX might be the ligand bound to the catalytic calcium. This is the first report on identification of homologous sequences between PhoX and the phosphotriesterase and on the potential calcium-binding site of PhoX

Development and Application of Methods for Molecular Epidemiological Analyses of Avian Influenza Viruses Isolated from Ducks in Taiwan

本計劃擬建立禽流感病毒全長基因體之快速增幅與核酸定序技術，並以此技術對台灣雞、鴨源之H5N2禽流感病毒，以及鴨源之H5N6、H5N8等病毒，進行其八段基因之全長基因體定序與分子流行病學分析，藉以探討台灣鴨源禽流感病毒之可能來源，並評估此鴨源流感病毒與雞源、人源流感病毒間之關連性，進而擬定策略，阻斷其入侵、傳播、與病毒間相互重組之可能性。上述技術之建立與其分析結果，將有助於台灣地區流感病毒之防治，並能協助推展台灣地區禽肉外銷工作。The aims of this study are to establishe a method for rapid amplification and sequence analyses of the complete genome of avian influenza viruses and employ this methodology for sequencing and phylogenetic analyses of the complete eight-segment genome of H5N2, H5N6 and H5N8 viruses isolated from chickens or ducks in Taiwan. The conduction of this study could help to identify the possible origins of these viruses and to evaluate the possibility of recombination occurring between these viruses in Taiwan, so as to establish a strategy to block the invasion, spreading and recombination of these viruses. The conduction of this study could help the prevetion of avian influenza in Taiwan and help the export of poultry meat from Taiwan to other countries

Construction of Gene-Deleted Live Vaccines for Chicken Infectious Laryngotracheitis

雞傳染性雞喉頭氣管炎(ILT)是一種嚴重的雞上呼吸道傳染疾病。除急性感染造成雞隻死亡外，此病之病毒也可在雞群之中持續性存在;引起產蛋率下降與死亡率提高，影響養雞業者之收益。ILT之防治需使用活毒疫苗，然而活毒疫苗仍可在雞群中造成持續性感染，甚至回復毒力，引起雞隻之死亡。此外，雞隻內之活毒疫苗也很難與田間強毒在血清學或分子生物學上予以區分，造成診斷上之困擾。本計劃擬以重組DNA技術，以本土性之ILTV毒株開發TK基因與病毒醣蛋白gI、gE等基因缺損疫苗株。TK基因缺損之病毒，其再活化之能力較一般病毒為低，而gI、gE基因缺損之病毒，除毒力較低外，亦可利用血清學之篩選，將其與田間強毒株做區分，進而使lLT之清除成為可能;本計劃之實施，將有助於本省ILT之防治與撲滅工作之進行

Establishment the Procedure for Antibody Detection and Methods for Disease Prevention of Goose Circovirus and Duck Circovirue in Taiwan

鵝環狀病毒(Goose circovirus,GoCV)與鴨環狀病毒(Duckcircovirus,DuCV)為新興之水禽傳染病源，此二病毒分別於1999 年及2003年間於德國地區首度發現，而台灣地區之GoCV 與DuCV，則是由本研究室分別於2001 年及2003 年間於雲林及屏東等地發現。序列分析結果顯示，台灣GoCV 分離株與德國GoCV 相當接近，但台灣DuCV 分離株則可分為兩型，一型為與德國DuCV 株類似者（96%序列相同性），另一型則為與德國DuCV 株相距較遠者（82%序列相同性）。除序列分析外，本研究室也建立了以PCR 及定量PCR 來診斷與區分GoCV 與DuCV 之技術。由於GoCV 與DuCV屬新發現之病毒，目前仍無任何抗體檢測方法與疫苗可供使用，本計劃即擬以兩年時間，對台灣地區鴨鵝環狀病毒之致病力、抗體檢測，與疫苗開發工作進行研究，研究之重點有四項：第一項為DuCV 不同基因型分離株（本土型與德國型）之致病力比較研究;第二項為建立GoCV 與DuCV 抗體力價檢測方法之標準程序，方法為以原核(E.coli)及真核（桿狀病毒/昆蟲細胞）系統，表現GoCV 與DuCV 之Rep 與Cap 蛋白作為抗原，另外也將進行病毒顆粒之純化作為抗原，再以上述三種來源之抗原，分別建立Western blot 與ELISA 技術，藉以評估何者為最佳抗原，並建立GoCV 與DuCV 抗體檢測之標準程序。第三項工作則是GoCV 與DuCV 次單位疫苗與不活化疫苗之研發，方法為以原核及真核系統所表現之Cap 蛋白，以及純化之病毒顆粒，分別研製不活化疫苗，並免疫鴨、鵝隻後，以攻毒試驗判定上述三種疫苗之效能，並評估次單位疫苗之潛力。第四項工作則是建立GoCV 與DuCV 之〝感染性選殖株〞(infectious clone)，並藉以開發GoCV與DuCV 之基因缺損活毒疫苗。本研究室目前已完成台灣DuCV〝感染性選殖株〞質體之構築工作，在此計劃中，將持續進行GoCV〝感染性選殖株〞之構築工作，並以肌肉注射、華氏囊內注射及其它方式測試其感染力。如獲成功，將再以定位突變法，針對病毒之promoter/enhancer 區域進行突變，藉以開發弱毒株疫苗。總結而言，雖然水禽環狀病毒之致病力目前仍未有定論，但近年來諸多研究顯示，分離自各種動物之環狀病毒，多數皆具致病性或免疫抑制能力。由於GoCV 與DuCV 屬新近發現之病毒，其相關之研究報告相當少，因此本研究之成果將具有重要學術價值，另一方面，由本研究所建立之抗體診斷技術與疫苗研發相關成果，也有助於台灣地區水禽類環狀病毒之防治，對本土養禽產業之競爭力將有所助益