Study on the effect of Cre-miR914 and Cre-miR918 on stress response of Chlamydomonas reinhardtii

逆境胁迫严重影响着全世界范围内的作物产量，要想解决这个问题，首先得弄清楚作物的抗胁迫机制。植物在进化过程中形成了对抗多种生物和非生物逆境胁迫的适应机制，包括在转录和转录后调控植物特定基因的表达。近年来，作为藻类中重要模式生物的莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）也被应用于生物胁迫、生物能源等方面的研究。另外，microRNA在藻类逆境胁迫适应过程中能发挥转录后水平的调控功能，这一发现也引起了越来越多科研人员的关注。但是microRNA在藻类逆境胁迫应答中的功能研究开展的工作并不多，因此本研究有着较好的创新意义，并有可能在将来的藻类培养中得到一定的应用。在本研究前期研究中，利用高通量测序技术对三种胁迫（UV-B、高温、盐胁迫）处理后的莱茵衣藻进行microRNA测序，结合生物信息学分析的方法，发现了两种microRNA在三种胁迫下都表现出差异性表达。第一种microRNA在上述三种逆境胁迫下表达量都下调，比如Cre-miR914；而第二种microRNA在三种逆境胁迫下表达量却都上调，比如Cre-miR918。为了验证测序结果，本研究对三种胁迫环境设置了胁迫时间梯度，采用不同胁迫时间下培养的莱茵衣藻，进行荧光定理PCR检测，实验结果证明了上述表达量变化一致的规律的确存在，确认了前期的测序实验结果。基于前面的研究，本研究对Cre-miR914和Cre-miR918这两个microRNA的靶基因进行了预测和实验验证。利用靶基因预测软件，找到了这两个microRNA可能的候选靶基因。为了获得一个更加确切的结果，本研究接着借助降解组测序技术和序列比对分析方法对候选靶基因进行了一一验证，结果显示Cre-miR914的靶基因是RPL18，而Cre-miR918的靶基因是ASO1。本研究利用实时荧光定量PCR技术，来分析在各种胁迫环境下培养的莱茵衣藻的microRNA及其靶基因的表达情况，结果表明microRNA和其对应靶基因的这种调控关系得到了进一步的验证。接着为了研究microRNA及其靶基因的功能，本研究成功构建了microRNA基因过表达质粒及其靶基因过表达质粒，将质粒转入莱茵衣藻，并经过巴龙霉素初筛、荧光素酶表达活性二筛和荧光定量PCR三筛，获得microRNA过表达藻株及其靶基因过表达藻株。在获得过表达藻株的基础上，本研究逆境胁迫培养过表达藻株，通过检测各藻株的光合活性、生长情况、色素含量、MDA以及ROS含量等生理指标对过表达藻株进行表型分析，并分析microRNA在生物逆境胁迫适应过程中的作用机制。本研究的主要结果如下：（1）在三种逆境胁迫下生长的莱茵衣藻，其Cre-miR914的表达量都表现出一致的下调；而Cre-miR918刚好与之相反，它的表达量却表现出一致的上调。（2）Cre-miR914的靶基因是RPL18，而Cre-miR918的靶基因是ASO1。（3）在三种逆境胁迫环境下，相对于野生型藻株，Cre-miR914过表达藻株表现出较弱的适应能力，而其靶基因RPL18过表达藻株的适应能力却很强。分析上述实验结果，本研究得出如下结论：（1）莱茵衣藻为了应对逆境胁迫，在机体内产生了一种应答机制，那就是通过microRNA表达上调或表达下调的途径来实现的。（2）莱茵衣藻中两种microRNA在三种逆境胁迫下出现表达量变化一致的现象，说明莱茵衣藻在应对各种逆境胁迫的过程中，可能存在某种普适性的调控机制，上述两种microRNA就是在这种机制中发挥作用的具有代表性的重要组分。（3）在莱茵衣藻应对三种逆境胁迫的过程中，可能存在如下应答机制：首先，受逆境胁迫所诱导，Cre-miR914表达量下调，而其靶基因RPL18表达量上调，从而调控其下游许多逆境诱导的基因的表达，由此刺激或诱导机体增加色素积累、加速细胞损伤修复、增强膜脂抗氧化系统的活性，从而来减少细胞损伤，以达到抵御逆境胁迫的目的