巨噬细胞移动抑制因子诱导血管生成相关基因的表达

【目的】研究巨噬细胞移动抑制因子（MIF）对人血管内皮细胞表达血管生成相关基因的诱导作用。【方法】通过亚克隆，构建原核表达质粒pET22b-MIF，并转化人工程菌B121（DE3）。用Ni-亲合柱分离纯化BL21（DE3）中经IPTG诱导表达的重组MIF。用巨噬细胞移动抑制试验鉴定复性的重组MIF的活性。分别用0、30、60、120ng／mL的重组MIF处理人血管内皮细胞12h，通过Real-time定量PCR检测人血管内皮细胞中VEGF165、FGFR3、MMP9、TGF-α、PDGF-α的mRNA表达。用体外血管生成试验检测重组MIF诱导人血管内皮细胞的成管腔作用。[结果]正确构建了重组质粒pET22b-MIF。经IPTG诱导，在大肠杆菌中以包涵体形式表达出重组MIF。复性的重组MIF对巨噬细胞移动的抑制水平达30％（P＜0.05）。重组MIF能特异地诱导HVECs中VEGF165、FGFR3、MMP9、TGF-α、PDGF-α表达，并能特异地诱导人血管内皮细胞形成管腔结构。【结论】在大肠杆菌中成功表达出MIF，MIF能特异地诱导人血管内皮细胞中血管生成相关基因的表达

人血管内皮生长因子的克隆表达及活性鉴定

【目的】克隆人血管内皮生长因子165 基因, 并测定蛋白质的表达及鉴定其活性。【方法】用PCR 法从人心脏 cDNA 文库中钓取目的基因VEGF165 , 插入质粒PUC19 中并测序鉴定。构建真核表达重组质粒AdtrackCMV-VEGF165 转染 293 细胞, 用RNA 斑点杂交和Wester n blot 方法检测VEGF165 基因表达, 并通过Miles 试验检测VEGF165 蛋白活性。【结 果】PCR 产物为582 bp , 测序结果表明其序列正确, 在RNA 和蛋白水平检测到VEGF165 基因表达, VEGF165 蛋白相对分子 质量为22 ku , 具有生物学活性。【结论】成功地克隆了有表达生物学活性的VEGF165 基因

G蛋白 βγ亚基介导的信号转导途径与心肌细胞肥大

导致心肌细胞肥大的胞外刺激因素通过 G 蛋白偶联受体将信号传人胞内。异三聚体G 蛋白由 α、β 和γ亚基所组成,最近发现 Gβγ可以激活 PI3Kγ、Ras、MAPKs 等,参与引起心肌细胞肥大反应的细胞内信号转导通路,可作为防治心肌肥厚的新靶点

细菌-酵母穿梭表达质粒pGBKT7-MIF 的构建及转化

【目的】构建并转化能在酵母菌AH109 中表达巨噬细胞游走抑制因子(MIF)的穿梭表达质粒pGBKT7-MIF 。 【方法】用RT-PCR 方法从人T 淋巴细胞中扩增MIF 基因全外显子片段, 并定向克隆入细菌-酵母穿梭表达质粒pGBKT7 中; 用PEG/ LiAC 法将pGBKT7-MIF 转化感受态酵母菌AH109 。提取转化酵母菌的质粒DNA , 转化大肠杆菌并行质粒的酶切鉴 定。【结果】扩增出人MIF cDNA 片段, 限制性内切酶酶切和DNA 测序证实获得正确的重组质粒pGBKT7-MIF ;获得可在色 氨酸缺陷培养基(SD/-trp)上生长含pGBKT7-MIF 的酵母菌克隆。酶切鉴定表明pGBKT7-MIF 已转化入酵母菌AH109 。【结 论】成功构建穿梭质粒pGBKT7-M IF, 并转化入酵母菌AH109