Efeito do inibidor de serinoproteases black-eyed pea trypsin and chymotrypsin inhibitor (BTCI) na ação hipotensora de bradicinina e análogos

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Laboratório de Biofísica, 2014.A bradicinina (Bk) é um nonapeptídeo vasodilatador que apresenta regiões com aminoácidos susceptíveis à ação de proteases. Quando metabolizada, a Bk não promove vasodilatação, devido à meia-vida reduzida. O objetivo deste trabalho é analisar a atividade da Bk e de dois análogos na presença de um inibidor de proteases denominado black-eyed pea trypsin/chymotrypsin (BTCI). Sistemas contendo BTCI e Bk e seus análogos foram caracterizados estruturalmente na forma de complexos moleculares, por métodos espectroscópicos. As atividades dessas moléculas nas formas livre e de complexos, bem como o efeito na contratilidade em músculo liso de cobaia, foram avaliadas em ensaios colorimétricos in vitro e ex vivo. Além disso, o efeito do BTCI na potencialização da ação hipotensora da Bk e dos seus análogos foi investigado por meio de ensaios in vivo em ratos normotensos. As dimensões moleculares do BTCI na presença dos peptídeos, monitoradas por espalhamento de luz dinâmico, indicou formação de complexos entre estas moléculas. Esse processo foi associado a alterações conformacionais na estrutura do BTCI, monitoradas por espectroscopia de dicroísmo circular distante do UV. Adicionalmente, ensaios enzimáticos mostraram que o BTCI mantém sua atividade inibitória contra proteases na presença dos peptídeos e impede a degradação de Bk e seus análogos por estas proteases. Os ensaios em íleo de cobaia demonstraram que Bk e seus análogos apresentam atividade na contração do músculo liso, que é mantida quando adicionadoso BTCI e as proteases. Quando o BTCI foi testado in vivo em ratos Wistar, associado à Bk e aos análogos, diminuição da resistência vascular e, consequentemente, da hipotensão, foram observadas, além da vasodilatação renal e aórtica, principalmente quando complexado com a Bk e a Bk2. O presente estudo mostrou a inibição de proteases pelo BTCI na presença de Bk e seus análogos e indica este inibidor como uma ferramenta promissora para o aumento dos efeitos da Bk que visem o controle da hipertensão. Além disso, foi mostrado que os análogos de Bk podem ser utilizados como estratégia para o desenvolvimento de um sistema hipotensor de ação prolongada.Bradykinin (Bk) is a vasodilator nonapeptide presenting amino acid residues susceptible to proteases cleavage. Bk does not promote vasodilation when metabolized due its reduced half-life in this condition. The aim of this study was to analyze the activity of Bk and two analogs in the presence of the protease inhibitor named black-eyed pea trypsin proteases/chymotrypsin, BTCI. The BTCI, Bk and its analogues were characterized by spectroscopic methods in free and complexes forms. Ex vivo assays using guinea pig ileum were carried out to monitor the activity of the molecules in solution. Furthermore, the potentiation of the hypotensive action of Bk and its analogues, in the presence of BTCI, was investigated in normotensive rats. The hydrodynamic diameters of BTCI in the presence of peptides,monitored by dynamic light scattering, indicated the formation of complexes between these molecules. It was associated with conformational changes of BTCI,indicated by far- UV circular dichroismspectroscopy. Additionally, enzymatic assays showed that BTCI retains its inhibitory activity against proteases in the presence of these peptides, inhibiting their proteolytic degradation. Tests on guinea pig ileum demonstrated that BK and its analogues exhibit activity on the smooth muscle in the absence and presence of BTCI. When BTCI was tested in vivo on Wistar rats, in the presence of Bk and its analogues, induced a decrease in vascular resistance and, consequently, hypotension, as well as renal and aortic vasodilation, mainly when in complex with Bk and Bk2. This study indicates BTCI as a promising tool for increasing the effects of Bk aiming hypertension control. Furthermore, it shows that BK analogues are good strategies for the development of a system for prolonged hypotensive action

SÍNDROME HEMOLÍTICA URÊMICA ATÍPICA (SHUA) PÓS TRANSPLANTE RENAL

Hemolytic uremic syndrome (HUS) is a disease that belongs to the group of thrombotic microangiopathies1, a serious disease defined by the triad of microangiopathic hemolytic anemia, thrombocytopenia and acute kidney injury. It is divided into two subtypes, the typical SHU and the atypical SHU (SHUa). This division is based on the clinical presentation and, mainly, on the causes of the syndrome. The aim of this study was to identify cases of recurrence of Atypical Hemolytic Uremic Syndrome after Kidney Transplantation. This is an integrative review of a qualitative approach, carried out from August 2019 to June 2020. References were sought such as: Scientific Eletronic Library Online, Brazilian Journal of Nephrology, Ministry of Health, MEDLINE and BDENF, where they were researched and studied 22, of which 6 were more relevant to the development of this work. The results of the study demonstrate that although it is considered a serious disease, there are few studies carried out on HUSA, and with a long period of time between publications, however the recurrence of HUSA after renal transplantation requiring drug treatment with Eculizumab is concluded. throughout life.A síndrome hemolítica urêmica (SHU) é uma doença que pertence ao grupo das microangiopatias trombóticas1 doença esta, grave definida pela tríade de anemia hemolítica microangiopática, trombocitopenia e lesão renal aguda. É dividida em dois subtipos, a SHU típica e a SHU atípica (SHUa). Essa divisão é baseada na apresentação clínica e, principalmente, nas causas da síndrome. O objetivo deste estudo foi identificar os casos de recorrência da Síndrome Hemolítica Urêmica Atípica Pós Transplante Renal. Trata-se de uma revisão integrativa de abordagem qualitativa, realizada nos meses de agosto de 2019 a junho de 2020. Buscou-se referências como: Scientific Eletronic Library Online, Jornal Brasileiro de Nefrologia, Ministério da Saúde, MEDLINE e BDENF, onde foram pesquisados e estudados 22, dos quais 6 tiveram mais relevância para o desenvolvimento deste trabalho. Os resultados do estudo demonstram que ainda que seja considerada uma doença grave, poucos são os estudos realizados sobre SHUa, e com longo intervalo de tempo entre as publicações, contudo conclui-se a recorrência de SHUa pós transplante renal necessitando de tratamento medicamentoso com Eculizumab ao longo da vida

Bowman-Birk protease inhibitor from Vigna unguiculata seeds enhances the action of bradykinin-related peptides

The hydrolysis of bradykinin (Bk) by different classes of proteases in plasma and tissues leads to a decrease in its half-life. Here, Bk actions on smooth muscle and in vivo cardiovascular assays in association with a protease inhibitor, Black eyed-pea trypsin and chymotrypsin inhibitor (BTCI) and also under the effect of trypsin and chymotrypsin were evaluated. Two synthetic Bk-related peptides, Bk1 and Bk2, were used to investigate the importance of additional C-terminal amino acid residues on serine protease activity. BTCI forms complexes with Bk and analogues at pH 5.0, 7.4 and 9.0, presenting binding constants ranging from 103 to 104 M−1. Formation of BTCI-Bk complexes is probably driven by hydrophobic forces, coupled with slight conformational changes in BTCI. In vitro assays using guinea pig (Cavia porcellus) ileum showed that Bk retains the ability to induce smooth muscle contraction in the presence of BTCI. Moreover, no alteration in the inhibitory activity of BTCI in complex with Bk and analogous was observed. When the BTCI and BTCI-Bk complexes were tested in vivo, a decrease of vascular resistance and consequent hypotension and potentiating renal and aortic vasodilatation induced by Bk and Bk2 infusions was observed. These results indicate that BTCI-Bk complexes may be a reliable strategy to act as a carrier and protective approach for Bk-related peptides against plasma serine proteases cleavage, leading to an increase in their half-life. These findings also indicate that BTCI could remain stable in some tissues to inhibit chymotrypsin or trypsin-like enzymes that cleave and inactivate bradykinin in situ

Activity of scorpion venom-derived antifungal peptides against planktonic cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms

The incidence of fungal infections has been increasing in the last decades, while the number of available antifungal classes remains the same. The natural and acquired resistance of some fungal species to available therapies, associated with the high toxicity of these drugs on the present scenario and makes an imperative of the search for new, more efficient and less toxic therapeutic choices. Antimicrobial peptides (AMPs) are a potential class of antimicrobial drugs consisting of evolutionarily conserved multifunctional molecules with both microbicidal and immunomodulatory properties being part of the innate immune response of diverse organisms. In this study, we evaluated 11 scorpion-venom derived non-disulfide-bridged peptides against Cryptococcus neoformans and Candida spp., which are important human pathogens. Seven of them, including two novel molecules, showed activity against both genera with minimum inhibitory concentration values ranging from 3.12 to 200 μM and an analogous activity against Candida albicans biofilms. Most of the peptides presented low hemolytic and cytotoxic activity against mammalian cells. Modifications in the primary peptide sequence, as revealed by in silico and circular dichroism analyses of the most promising peptides, underscored the importance of cationicity for their antimicrobial activity as well as the amphipathicity of these molecules and their tendency to form alpha helices. This is the first report of scorpion-derived AMPs against C. neoformans and our results underline the potential of scorpion venom as a source of antimicrobials. Further characterization of their mechanism of action, followed by molecular optimization to decrease their cytotoxicity and increase antimicrobial activity, is needed to fully clarify their real potential as antifungals

Obtenção e caracterização estrutural de uma leucil-aminopeptidase de Leptospira interrogans sorovar hordjo expressa em Escherichia coli "BL21-DE3"

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010.Neste trabalho apresentamos estudo biofísico e estrutural de uma leucil aminopeptidase (LAP), proteína recombinante expressa em Escherichia coli e presente em Leptospira interrogans sorovar Hardjo (LAPr-Li). Essa proteína está diretamente relacionada com a patogenicidade dessa bactéria e com a doença leptospirose em animais e humanos. A LAPr-Li foi obtida por transformação do vetor pET19b-HapepA em E. coli BL21-DE3, expressa a 20ºC, após indução com IPTG 0,3 mM, e purificada por cromatografia de afinidade e de exclusão molecular. Essa enzima apresenta atividade ótima na forma hexamérica em pH 8,5 e temperatura 50ºC. A LAPr-Li é formada por dímeros de trímeros formando o hexâmero, cuja atividade depende desta estrutura. A estrutura secundária é constituída de 44,7% de ?-hélice e 11,6% por folhas-?. A forma hexamérica, de diâmetro 15,2 nm e massa molecular 320 kDa, foi confirmada por ensaios de oligomerização dependentes da temperatura, por espalhamento de luz dinâmico. Estudos de atenuação de fluorescência, utilizando atenuadores carregados e neutros e ajustes de Stern-Volmer, revelaram que a proteína apresenta duas populações de triptofanos. A caracterização dos microambientes foi baseada nas constantes de Stern-Volmer (KSV) obtidas para atenuação com cloreto de césio, apresentou maior acesso aos resíduos de triptofanos, quando comparado ao iodeto de potássio, carregado negativamente. As constantes de atenuação de fluorescência para o césio foram KSV1= 38,6 M-1 e KSV2= 6,4 M-1 e para iodeto KSV1= 4,4 M-1 e KSV2= 0,4M-1. A estabilidade estrutural da LAPr-Li foi analisada a partir de curvas de desnaturação térmica e química obtidas por dicroísmo circular. A elevação da temperatura para 50ºC em pH 8,5 induziu modificações na estrutura secundária e, consequentemente, na conformação da proteína. As curvas de desnaturação térmica (25-95ºC) indicaram maior estabilidade estrutural da LAPr-Li nos pHs 3,0 e 5,0, onde nenhuma alteração estrutural e desnaturação foi observada. Em região alcalina (8,0, 8,5 e 9,0) a LAPr-Li não é desnaturada completamente, resultando, portanto, em valores de ?G25 mais baixos (~2,0 kcal.mol-1) comparados àqueles obtidos nos pHs 6,0 (3,52 kcal.mol-1) e 7,0 (6,63 kcal.mol-1), onde a proteína se desnaturou completamente. Esse último resultado foi confirmado com a curva de desnaturação, utilizando cloridrato de guanidina em água, onde a desnaturação completa da LAPr-Li resultou no valor de ?GH2O de 6,32 kcal. mol-1. _________________________________________________________________________________ ABSTRACTIn this work we present the biophysical studies of the leucine aminopeptidase (LAP), a recombinant protein expressed in Escherichia coli and present in Leptospira interrogans serovar Hardjo (LAPr-Li). This protein is related to pathogenicity of the bacteria and the leptospirosis disease in animals and humans. The LAPr-Li was obtained by transformation of the vector pET19b-HapepA in E. coli BL21-DE3, expressed at 20°C after induction with 0.3 mM IPTG, and purified by affinity and size exclusion chromatography. The enzyme presents optimal activity as hexamer at pH 8.5 and 50°C. LAPr-Li is self assembled as hexamer from trimers of dimmers and its secondary structure consists of 44.7% α-helix and 11.6% for β-sheets. The hexamer with diameter of 15.2 nm and molecular weight 320 kDa was confirmed by dynamic light scattering oligomerization assays. Fluorescence decay studies using charged and neutral quenchers and Stern-Volmer fitting revealed two different populations of tryptophan (exposed and buried) in negatively charged microenvironment. The cesium chloride had greater access to tryptophan residues, when compared to potassium iodide, negatively charged. The constants of fluorescence decay for cesium was KSV1 = 38.6 M-1 and KSV2 = 6.2 M-1 and iodide KSV1 = 4.4 M-1 and KSV2 = 0.4 M-1. The structural stability of LAPr-Li was analyzed from thermal and chemical denaturation curves by circular dichroism spectroscopy. The increase of temperature to 50ºC at pH 8.5 induced secondary structure and conformational changes of the protein. It promotes flexibility of the enzyme that appears to be essential for enzymatic activity. The thermal denaturation curves (25-95ºC) indicated higher structural stability of LAPr-Li at pH 3.0 and 5.0 in which no denaturation profile was observed. At pH 8.0, 8.5 and 9.0 LAPr-Li was partially denatured resulting in lower values of G25 (~ 2.0 kcal.mol-1) compared to those obtained at pH 6.0 (3.52 kcal.mol-1) and 7.0 (6.63 kcal.mol-1), where the protein was completely denatured. The latter result was confirmed by denaturation using aqueous solution of guanidine hydrochloride, where the complete denaturation of LAPr-Li resulted in GH2O value of 6.32 kcal.mol-1

Estudo comparativo das propriedades físico-químicas de comprimidos de cloridrato de metformina comercializados no interior de Goiás

A adoção de medidas para verificação da qualidade dos medicamentos deve ser uma preocupação constante dos consumidores e das agências reguladoras oficiais. Com a diversidade de marcas de medicamentos existentes com o mesmo principio ativo, levantou-se o questionamento se esses remédios seriam equivalentes, demonstrando os mesmos resultados que o medicamento de referencia. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo realizar um estudo comparativo dos comprimidos de metformina comerciais disponíveis nas cidades do interior de Goiás e certificar se estes medicamentos estão de acordo com as especificações da farmacopéia e aptos para o consumo da população. As amostras foram analisadas em relação ao aspecto, dureza, peso médio, desintegração, teor e dissolução do fármaco in vitro. As três marcas de produtos contendo cloridrato de metformina 1g avaliadas, quando submetidas aos testes de aferição de qualidade, mostraram-se representativas de um lote de qualidade satisfatória, apresentando propriedades que as qualificaram, segundo os testes realizados, como um produto adequado para o uso terapêutico.  </p

A trombose venosa profunda como reação adversa do uso contínuo de anticoncepcionais orais

O objetivo dessa pesquisa foi relacionar as alterações no sistema hemostático com o uso contínuo dos anticoncepcionais orais e a ocorrência da trombose venosa profunda. Hemostasia é um processo fisiológico que tem como finalidade manter o sangue fluindo dentro dos vasos sanguíneos, assim evitando a formação de coágulos. Trombose venosa profunda é uma doença grave, caracterizada pela formação de coágulos em veias profundas, destacam-se os fatores de risco: hereditários, adquiridos e associação provável. Foi realizado um levantamento bibliográfico nas bases e banco de dados. Para a obtenção dos resultados foram analisados 11 artigos. Esses estudos demostram que estrogênio e progestagenios desencadeiam alterações significantes no sistema hemostático por sua ação androgênica, resultando na formação de fibrina, podendo acontecer à formação de coágulos nas veias. Devido os AOs ser o método mais utilizado no mundo, torna-se se suma importância o conhecimento das reações adversas consideradas graves, como a TVP. </p

Implementation of the Reverse Drug Collection Point in a Higher Education Institution of the Federal District

Objective: To provide the academic and social community with the correct storage and disposal practices for expired, disused and/or inappropriate medicines in the higher education institution in the Federal District. Method: The collection of medicines took place within one year, between 2018 and 2019. The permanent collection box was opened at the Higher Education Institution and the manual counting of all discarded medicines. The drugs were listed in a spreadsheet according to bioequivalence classification, routes of administration, pharmaceutical forms, validity, preparation and therapeutic class. Results: Thus, the fixed active point of collection of discarded medicines in the Higher Education Institution provides a great social and environmental impact, collaborating with orientations in the society as well as promoting a permanent action of assistance to the government agencies to promote actions of correct destination of. medications that have been discarded. In the period of 1 (one) year, out of a total of 922 units, being 84 different drugs, the predominance was similar drugs. Among the routes of administration, the drugs administered orally were the most discarded. In addition, it is observed that this point was installed 1 year ago, that is, in August 2018, and medicines have been counted since 2012, that is, the population has the habit of storing these medicines even at home. Conclusion: There was a need for better clarification on the subject through incentive and orientation campaigns, as to the appropriate destination for drug residues and promotion of the rational use of medicines, in order to make society aware of the moderate use of medicines and implementation of collection points accessible to the population.</p

Uso de EPI’s pelos profissionais de saúde da atenção básica de um município de Goiás

Objetivo: compreender o entendimento dos profissionais de saúde básica de um município de Goiás, no que se refere a utilização dos Equipamentos de Proteção Individual, focado nos Técnicos de Enfermagem e Enfermeiros dos postos de saúde. Método: foram elaborados questionários sobre a mesma abordagem para esses profissionais, refletindo na parcialidade de retorno dos questionários entregues, embora não influenciou no estudo pretendido, por se tratar de uma pesquisa por amostragem. Resultados: Foram submetidos ao estudo por meio deste recurso, 13 (treze) Técnicos de Enfermagem e 20 (vinte) Enfermeiros. Diante do recurso utilizado, seguiu-se a pesquisa a luz de autores que abordam o tema em estudo. Conclusão: embora pareça lógico, algumas intervenções precisam ser feitas no sentido de melhorar o uso dos EPIs em meio aos profissionais que constituem o sistema de saúde desde um município até a configuração nacional, pois o entendimento é que o todo se constitui por unidades