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    Análisis proteómico y bioquímico del regulador autoinmune : nuevas funcionalidades y vías de degradación de aire

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    El timus √©s l'√≤rgan on es genera el repertori de limf√≤cits T que circularan per perif√®ria. Per tal que aquest repertori sigui immunocompetent, √©s a dir, prou divers per al reconeixement de tots els pat√≤gens existents i sigui m√≠nimament autoreactiu, es requereix una selecci√≥ exhaustiva al timus. La toler√†ncia central evita en gran mesura la maduraci√≥ dels limf√≤cits T amb potencial autoreactiu. Aquesta consisteix en l'eliminaci√≥ de tim√≤cits autoreactius durant la selecci√≥ t√≠mica per dos processos: una selecci√≥ t√≠mica positiva a la escor√ßa, on sobreviuran tim√≤cits que puguin recon√®ixer mol√®cules pr√≤pies del Complex Major d'Histocompatibilitat (MHC) associades amb p√®ptids propis; i d'una subseq√ľent selecci√≥ negativa a la medul¬∑la, en que s'eliminaran aquells que reconeixin complexos MHC-p√®ptid propis amb alta afinitat. Perqu√® la selecci√≥ negativa sigui eficient ser√† necess√†ria l'expressi√≥ del proteoma complet de l'organisme. El Regulador Autoimmune (AIRE) √©s la prote√Įna encarregada de dirigir la major part de l'expressi√≥ ect√≤pica d'ant√≠gens restringits a teixits i √≤rgans (TRAs) per part de les c√®l¬∑lules epitelials t√≠miques (mTECs), on √©s expressat majorit√†riament. AIRE √©s una prote√Įna multi-domini relacionada amb la regulaci√≥ de l'expressi√≥ transcripci√≥ g√®nica, apoptosi, diferenciaci√≥ cel¬∑lular i, fins i tot, cicle cel¬∑lular. Mutacions al gen d'AIRE provoquen l'anomenada Poliendocrinopatia Autoimmune de tipus 1 (APS-1), malaltia autoimmune monog√®nica i poli-org√†nica, que cursa habitualment amb autoanticossos en sang i infiltrats limfocitaris a causa d'irregularitats al proc√©s de toler√†ncia central. Pr√®viament, el nostre grup va identificar difer√®ncies a nivell prote√≤mic en comparar c√®l¬∑lules que expressen AIRE amb d'altres que no. Aquelles c√®l¬∑lules que expressaven AIRE, van presentar un augment en l'expressi√≥ de prote√Įnes pro-apopt√≤tiques amb una conseg√ľent inducci√≥ de l'apoptosi, respecte de les c√®l¬∑lules control. Calcyclin-Binding Protein o SIAH1 Interacting Protein (CACYBP/SIP) va ser identificada com una de les prote√Įnes incrementades, la qual √©s una prote√Įna adaptadora que desenvolupa activitats relacionades amb degradaci√≥ via ubiquitina-proteasoma. A la seva seq√ľ√®ncia, es troba l'anomenat motiu d'interacci√≥ amb Seven in Absentia Homolog 1 (SIAH1), una E3 ubiquitina lligasa de tipus RING. Aquesta fam√≠lia t√© dos membres catal√≠ticament funcionals: SIAH1 i SIAH2. Totes dues s√≥n regulades en resposta a diferents senyals: SIAH1 √©s expressada en resposta a dany genot√≤xic i, SIAH2, en resposta a hip√≤xia. Aquestes E3 ubiquitina lligases comparteixen alguns substrats espec√≠fics, part dels quals estan relacionats amb AIRE. Una an√†lisi de seq√ľ√®ncia proteica d'AIRE va permetre identificar la pres√®ncia de dos motius d'interacci√≥ amb SIAH1: un complet i un altre amb una mutaci√≥ conservadora. A aquesta tesi s'han caracteritzat, mitjan√ßant t√®cniques bioqu√≠miques i prote√≤mica quantitativa, alguns aspectes relacionats amb la prote√Įna AIRE i l'efecte de la seva expressi√≥ a l√≠nies cel¬∑lulars que puguin permetre trobar-hi noves funcions de la prote√Įna. En primer lloc, s'han comparat, per mitj√† de t√®cniques de prote√≤mica quantitativa (iTRAQ) i d'an√†lisi de repertoris de p√®ptids derivats d'HLA-I, els proteomes i els peptidomes de c√®l¬∑lules que expressaven AIRE de manera diferencial, respectivament. Aquest tipus d'estudi no s'havia realitzat fins ara. De manera addicional, s'han mapejat els dominis d'AIRE implicats en apoptosi. A m√©s, aquesta aproximaci√≥ ha perm√®s identificar la relaci√≥ de l'expressi√≥ d'AIRE amb un increment de la mobilitat cel¬∑lular. En segon lloc, s'ha caracteritzat una nova localitzaci√≥ de la prote√Įna en c√®l¬∑lules post-mit√≤tiques, a prop del midbody. Tamb√© s'ha aconseguit mostrar la localitzaci√≥ d'AIRE durant tot el cicle cel¬∑lular i, m√©s concretament, a les diferents fases de la mitosi. En √ļltim lloc, s'ha caracteritzat bioqu√≠micament i funcionalment la interacci√≥ entre AIRE i les E3 ubiquitina lligases de la fam√≠lia de SIAH, mostrant que AIRE interacciona amb SIAH1 i SIAH2 a trav√©s del primer motiu d'interacci√≥. Aquesta interacci√≥ permet la ubiquitinaci√≥ d'AIRE i la seva degradaci√≥. Aquest efecte √©s m√©s notori amb SIAH1.El timo es el √≥rgano donde se genera el repertorio de linfocitos T que circular√° por la periferia. Para que este repertorio sea inmunocompetente y m√≠nimamente autorreactivo se requiere una selecci√≥n exhaustiva en el timo. La tolerancia central evita en gran medida la maduraci√≥n de linfocitos T con potencial autorreactivo. Consiste en la eliminaci√≥n de timocitos autorreactivos durante la selecci√≥n t√≠mica a trav√©s de dos procesos: una selecci√≥n positiva en la corteza, donde sobrevivir√°n timocitos que logren reconocer mol√©culas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) propias asociados a p√©ptidos propios; y de una selecci√≥n negativa en la m√©dula, que eliminar√° aquellos que reconozcan complejos MHC-p√©ptido propios con alta afinidad. Para que la selecci√≥n negativa sea eficiente ser√° necesaria la expresi√≥n de todas las prote√≠nas presentes en el organismo. El Regulador Autoinmune (AIRE) es la prote√≠na encargada de dirigir gran parte de la expresi√≥n ect√≥pica de ant√≠genos restringidos a tejidos y √≥rganos (TRAs) por parte de las c√©lulas epiteliales t√≠micas medulares (mTECs), donde se expresa mayoritariamente. AIRE es una prote√≠na multidominio relacionada con la regulaci√≥n de la expresi√≥n y transcripci√≥n g√©nica, apoptosis, diferenciaci√≥n celular e incluso ciclo celular. Mutaciones en el gen de AIRE provocan la denominada Poliendocrinopat√≠a Autoinmune de tipo 1 (APS-1), enfermedad autoinmune monog√©nica y poliorg√°nica, cursando habitualmente con autoanticuerpos en sangre e infiltrados linfocitarios debido a irregularidades en el proceso de tolerancia central. En un trabajo previo de nuestro grupo se determinaron diferencias a nivel prote√≥mico comparando c√©lulas que expresaban AIRE con las que no. Aquellas c√©lulas que expresaban AIRE presentaban un aumento en la expresi√≥n de prote√≠nas pro-apopt√≥ticas con una consecuente inducci√≥n en la apoptosis respecto a las c√©lulas control, as√≠ como un incremento en prote√≠nas de tipo chaperona y una disminuci√≥n de prote√≠nas relacionadas con el citoesqueleto. Entre las prote√≠nas incrementadas se encontr√≥ la Calcyclin-Binding Protein o SIAH1-Interacting Protein (CACYBP/SIP). Es una prote√≠na adaptadora que contiene un motivo de uni√≥n a una E3 ubiquit√≠n ligasa, Seven In Absentia Homologe 1 (SIAH1). SIAH1 pertenece a una familia de E3 ubiquit√≠n ligasas de tipo RING. Posee tres miembros, dos de ellos catal√≠ticamente funcionales: SIAH1 y SIAH2 que presentan una elevada similitud de secuencia pero con actividades antag√≥nicas. SIAH1 es pro-apopt√≥tica y SIAH2 pro-oncog√©nica. Su regulaci√≥n est√° determinada en respuesta a se√Īales de da√Īo genot√≥xico e hipoxia, respectivamente. Ambas prote√≠nas comparten sustratos, presentando algunos de ellos relaci√≥n con la prote√≠na AIRE. Un an√°lisis de la secuencia proteica de AIRE permiti√≥ observar que la prote√≠na conten√≠a dos posibles motivos de uni√≥n a SIAH1, uno completo y otro con una mutaci√≥n conservadora. En la presente tesis se han caracterizado, mediante t√©cnicas bioqu√≠micas y de prote√≥mica cuantitativa, varios aspectos relacionados con AIRE y el efecto de su expresi√≥n en l√≠neas celulares, que han permitido encontrar nuevas posibles funciones de la prote√≠na: En primer lugar, se han comparado mediante t√©cnicas de prote√≥mica cuantitativa (iTRAQ) los proteomas de c√©lulas que expresaban AIRE de forma diferencial y se han comparado los peptidomas de HLA-I de las mismas c√©lulas, estudio que no se hab√≠a realizado hasta el momento. Adicionalmente se han mapeado los dominios de AIRE para inducir apoptosis. Finalmente, esta aproximaci√≥n ha permitido mostrar que AIRE induce un incremento en la movilidad celular. En segundo lugar, se ha caracterizado una nueva localizaci√≥n de la prote√≠na AIRE en c√©lulas post-mit√≥ticas, cerca del midbody. Asimismo, se ha logrado mostrar la localizaci√≥n de AIRE a lo largo del ciclo celular y, m√°s concretamente, en las diferentes fases de la mitosis; En √ļltimo lugar, se ha caracterizado bioqu√≠mica y funcionalmente la interacci√≥n entre AIRE, SIAH1 y SIAH2 a trav√©s del primer motivo de interacci√≥n, permitiendo su poli-ubiquitinaci√≥n y degradaci√≥n.The thymus is the organ where the repertoire of circulating T lymphocytes is generated. An exhaustive selection whitin the thymus is required in order to generate an immunocompetent T cell repertoire: broadly diverse for recognizing pathogens but minimally autoreactive. Central tolerance is based on the successfully maturation of T cells by an appropriate interaction with self Major Histocompatibility Complex (MHC)/peptide complexes. This process consists in a positive selection which takes place in the cortex and a negative selection carried out in the thymic medulla. In the cortex, only thymoctes carrying a functional TCR able to recognize self MHC molecules will survive. In the medulla, thymocytes that recognize self MHC/peptides complexes are eliminated. For negative selection to be efficient it will be necessary the expression of the whole proteome of the body. The Autoimmune Regulator (AIRE) leads the ectopic expression of antigens restricted to tissues and organs (TRAs) by medullary thymic epithelial cells (mTECs). AIRE is a multidomain protein related to the regulation of gene expression and transcription, apoptosis, cell differentiation and cell cycle. Mutations in AIRE gene cause the so-called Autoimmune Polyendocrinopathy type 1 (APS-1), a monogenic and polyorganic autoimmune disease, characterized by the presence of autoantibodies in the blood and lymphocytic infiltrates due to a defective central tolerance process Previous findings of our group showed differences between the proteomes of differentially AIRE expressing cells. AIRE+ cells increased the expression of chaperones and apoptosis-related proteins and dampened cytoskeleton-associated proteins compared to control cells. One of the increased proteins was Calcyclin-Binding Protein or SIAH1-Interacting Protein (CACYBP/SIP), an adaptor protein involved in ubiquitin-proteasome mediated protein degradation. SIP interacts with Seven in Absentia Homologue 1 (SIAH1) E3 ubiquitin ligase through the SIAH1 binding motif. SIAH1 and SIAH2 belongs to SIAH RING-type E3 ubiquitin ligase family. SIAH1 is expressed in response to genotoxic damage while SIAH2 is increased under hypoxia conditions. Both E3 ubiquitin ligases share specific targets, some of them related with AIRE. Protein sequence analysis showed the presence of two possible SIAH1 binding motifs in AIRE sequence: one with the complete sequence and the other with a conservative mutation. In this thesis, some aspects related to AIRE and the effect of its expression in cell lines have been characterized using biochemical and proteomics techniques, which may allow us to find new functions of the protein: First, using quantitative proteomics techniques (iTRAQ) and HLA-I derived peptides repertoire analysis the proteomes and the peptidomes of differentially AIRE expressing cells have been analyzed. A study that had not been carried out up to now. Additionally, the AIRE domains involved in apoptosis have been identify. Finally, this approach has allowed us to show that AIRE induces an increase in cell mobility. Second, a new localization of the AIRE protein has been characterized in post-mitotic cells, surrounding the midbody. Likewise, it has been possible to show the location of AIRE throughout the cell cycle and in different mitotic phases. Third the interaction between AIRE and the E3 ubiquitin ligases of the SIAH family has been biochemically and functionally characterized. AIRE interacts with SIAH1 and SIAH2 through the first interaction motif. SIAH1 leads to the polyubiquitination and degradation of AIRE. That effect is slightly observed in the case of SIAH2 although polyubiquitinated AIRE is also detected

    Possibile ruolo protrombotico delle vescicole extracellulari durante riacutizzazione di broncopneumopatia cronica ostruttiva

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    La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) √® una malattia comune, caratterizzata dalla presenza di sintomi respiratori persistenti e da limitazione irreversibile al flusso aereo, e rappresenta una delle pi√Ļ importanti cause di morbidit√† e mortalit√† al mondo. I principali fattori di rischio sono l‚Äôesposizione a inalanti tossici, come il fumo di sigaretta e l‚Äôinquinamento ambientale, che innescano una risposta infiammatoria a livello delle vie aeree, la quale risulta essere alla base delle alterazioni patologiche fondamentali caratterizzanti la patologia: la malattia delle piccole vie aeree e l‚Äôenfisema. Tuttavia, ormai √® noto come nella BPCO l‚Äôinfiammazione non sia presente unicamente a livello locale polmonare, ma si estenda anche a livello sistemico: infatti esistono alcuni studi che hanno evidenziato la presenza di elevate concentrazioni di molecole proinfiammatorie come proteina C reattiva (PCR), fibrinogeno, fattore di necrosi tumorale (TNFőĪ) e altre citochine nel circolo sistemico. La BPCO, pur essendo una malattia cronica e progressiva, √® caratterizzata dalla ricorrenza di episodi di peggioramento acuto della sintomatologia, definite riacutizzazioni. Tali episodi, causati principalmente da agenti infettivi, sono caratterizzati da un‚Äôamplificazione, in genere temporanea, della risposta infiammatoria gi√† presente in fase di stabilit√†. Le riacutizzazioni rappresentano un determinante essenziale di salute del paziente con BPCO, data la loro associazione significativa con la qualit√† della vita e soprattutto con la mortalit√† in questi pazienti. √ą ormai noto da studi epidemiologici come le riacutizzazioni di BPCO siano caratterizzate da un aumentato rischio di eventi trombotici, sia tipo arterioso che venoso. Questo aumentato rischio pu√≤ essere dovuto ad una ‚Äúiperattivazione‚ÄĚ della coagulazione, secondaria verosimilmente all‚Äôesacerbazione dell‚Äôinfiammazione sistemica. Esiste infatti una connessione molto stretta tra infiammazione e coagulazione, tanto che il processo infiammatorio sembra attivare i principali effettori della formazione del coagulo tra cui le piastrine, l‚Äôendotelio e la cascata coagulativa: in questo senso, si parla ormai sempre pi√Ļ spesso di trombo-infiammazione. Nel contesto della riacutizzazione di BPCO, alcuni studi hanno riscontrato un‚Äôalterazione della reattivit√† piastrinica, dell‚Äôattivazione endoteliale e uno stato di ipercoagulabilit√†, tanto da poter definire questa condizione come stato protrombotico. Un argomento di recente interesse nella BPCO sono le vescicole extracellulari (EV). Le EV sono un gruppo eterogeneo di vescicole (esosomi, microvescicole e corpi apoptotici) di dimensioni da 30 nm a pochi ¬Ķm, circondate da membrana fosfolipidica, e rilasciate nei fluidi extracellulari potenzialmente da parte di tutte le cellule, in risposta a stimoli di attivazione o di apoptosi. Sono considerati mediatori della comunicazione intercellulare in quanto trasportano un carico di molecole bioattive tra cui proteine citosoliche e materiale genetico, e sembrano partecipare sia a processi omeostatici ma anche fisiopatologici, come l‚Äôinfiammazione, la coagulazione e la trombosi. Le EV sono state studiate anche per la loro attivit√† procoagulante, dovuta all'espressione sulla loro superficie di fosfolipidi carichi negativamente come la fosfatidilserina (PS), essenziale per l‚Äôassemblaggio del complesso della protrombinasi, e di fattore tissutale (TF), l‚Äôiniziatore della via estrinseca della cascata coagulativa. Elevati livelli di EV, infatti, si rilevano in malattie ad elevata tendenza alla trombosi come nelle malattie cardiovascolari, quali la sindrome coronarica acuta e l‚Äôictus. Avendo quindi le EV un‚Äôattivit√† procoagulante, e potendo pertanto essere effettrici biologiche nella patogenesi della trombosi, lo scopo di questo studio √® quello di valutare il potenziale ruolo protrombotico delle EV durante la riacutizzazione di BPCO, condizione che abbiamo detto essere caratterizzata da un eccesso di eventi trombotici. E‚Äô stato condotto uno studio osservazionale, con doppio disegno. Sono stati arruolati due gruppi di pazienti: il primo gruppo, costituito da pazienti con diagnosi sospetta di riacutizzazione di BPCO, √® stato valutato in due tempi, entro 48h dall‚Äôaccesso in Pronto Soccorso (VO) e nel periodo di risoluzione dopo 6-8 settimane (V1), mentre il secondo gruppo, costituito da pazienti con diagnosi di BPCO in fase di stabilit√†, √® stato valutato in unico tempo. Ai soggetti con diagnosi sospetta di riacutizzazione al tempo V0, √® stata effettuata un‚Äôiniziale valutazione clinica, comprensiva della raccolta dei principali dati anamnestici e di parametri clinici, oltre ad essere stato effettuato un prelievo di sangue venoso per il dosaggio di EV. Al tempo V1 gli stessi soggetti sono stati rivalutati con una visita, eseguite le prove di funzionalit√† respiratoria e valutato, alla luce delle informazioni acquisite durante la visita, se l‚Äôepisodio acuto era attribuibile ad una riacutizzazione di BPCO; in questo caso il paziente √® stato assegnato al gruppo di BPCO riacutizzata (gruppo R). Inoltre, √® stato eseguito un prelievo venoso per il dosaggio delle EV. I soggetti con diagnosi di BPCO in fase di stabilit√† (gruppo S) sono stati valutati in unico tempo V1 in cui √® stata effettuata una visita che ha compreso la raccolta di dati anamnestici, le prove di funzionalit√† respiratoria e il prelievo di sangue venoso per il dosaggio delle EV. I metodi utilizzati hanno previsto l‚Äôisolamento delle EV dal sangue periferico raccolto, la valutazione della concentrazione delle EV totali e dell‚Äôattivit√† del fattore tissutale legato alle EV (EV-TF). Dal nostro campione in studio, composto da 19 pazienti, di cui 10 con diagnosi presuntiva di riacutizzazione di BPCO (4 di questi sono stati persi nel follow-up) e 9 con diagnosi di BPCO in fase di stabilit√†, √® emerso che i pazienti in corso di riacutizzazione di BPCO al momento dell‚Äôaccesso al Pronto Soccorso (V0) presentavano livelli di EV e EV-TF significativamente pi√Ļ elevati rispetto sia alla fase di risoluzione (V1 a 6-8 settimane), sia al gruppo di pazienti in fase di stabilit√†. Il riscontro di elevati livelli di EV in fase di riacutizzazione √® coerente con quanto gi√† osservato in letteratura. A differenza di questi studi, che hanno caratterizzato morfologicamente il tipo di EV, nel nostro studio abbiamo voluto indagare il loro potenziale funzionale. √ą stato ricercato, infatti, sulla membrana delle EV la presenza di fosfatidilserina (PS), cofattore dei principali passaggi della cascata coagulativa. Inoltre, dai nostri esperimenti √® stato riscontrato che i valori di fattore tissutale legato alle EV (TF-EV) erano significativamente pi√Ļ elevati all‚Äôinizio della riacutizzazione rispetto alla fase di risoluzione. Dati in letteratura riportano elevati livelli di TF circolanti, sia in fase di riacutizzazione che in fase stabile di malattia. Tuttavia, nessuno studio ha dosato il TF direttamente legato alle EV che quindi risulta essere un dato innovativo. Dal momento che il TF rappresenta l‚Äôiniziatore della via estrinseca della coagulazione e PS, un cofattore determinante nell‚Äôassemblaggio di proteasi della cascata coagulativa, possiamo quindi affermare che le EV possono rappresentare, fornendo PS e TF, un ideale substrato per l‚Äôattivazione della coagulazione durante la riacutizzazione di BPCO. Dato che dai nostri risultati √® emerso che anche i livelli di EV totali e TF-EV erano pi√Ļ elevati durante riacutizzazione rispetto ad un campione di soggetti con BPCO stabile, si pu√≤ ulteriormente confermare che la riacutizzazione si associa ad uno stato protrombotico anche rispetto alla malattia stabile. Alla luce del fatto che la riacutizzazione sia caratterizzata da un‚Äôamplificazione della risposta infiammatoria sistemica e che esista una connessione stretta tra infiammazione e coagulazione, √® possibile ipotizzare che le EV svolgono un ruolo biologico importante nella genesi di eventi trombotici che sappiamo, da studi epidemiologici, essere molto frequenti durante le riacutizzazioni. I nostri risultati suggeriscono quindi un potenziale meccanismo biologico alla base dei processi trombotici che possono verificarsi durante una riacutizzazione di BPCO. Nel futuro, se tali meccanismi biologici venissero confermati su grandi numeri, potrebbero essere alla base anche di studi riguardanti terapie finalizzate a ridurre gli eventi trombotici durante riacutizzazione di BPCO

    Análisis proteómico y bioquímico del regulador autoinmune: nuevas funcionalidades y vías de degradación de aire

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    El timus √©s l‚Äô√≤rgan on es genera el repertori de limf√≤cits T que circularan per perif√®ria. Per tal que aquest repertori sigui immunocompetent, √©s a dir, prou divers per al reconeixement de tots els pat√≤gens existents i sigui m√≠nimament autoreactiu, es requereix una selecci√≥ exhaustiva al timus. La toler√†ncia central evita en gran mesura la maduraci√≥ dels limf√≤cits T amb potencial autoreactiu. Aquesta consisteix en l‚Äôeliminaci√≥ de tim√≤cits autoreactius durant la selecci√≥ t√≠mica per dos processos: una selecci√≥ t√≠mica positiva a la escor√ßa, on sobreviuran tim√≤cits que puguin recon√®ixer mol√®cules pr√≤pies del Complex Major d‚ÄôHistocompatibilitat (MHC) associades amb p√®ptids propis; i d‚Äôuna subseq√ľent selecci√≥ negativa a la medul¬∑la, en que s‚Äôeliminaran aquells que reconeixin complexos MHC-p√®ptid propis amb alta afinitat. Perqu√® la selecci√≥ negativa sigui eficient ser√† necess√†ria l‚Äôexpressi√≥ del proteoma complet de l‚Äôorganisme. El Regulador Autoimmune (AIRE) √©s la prote√Įna encarregada de dirigir la major part de l‚Äôexpressi√≥ ect√≤pica d‚Äôant√≠gens restringits a teixits i √≤rgans (TRAs) per part de les c√®l¬∑lules epitelials t√≠miques (mTECs), on √©s expressat majorit√†riament. AIRE √©s una prote√Įna multi-domini relacionada amb la regulaci√≥ de l‚Äôexpressi√≥ transcripci√≥ g√®nica, apoptosi, diferenciaci√≥ cel¬∑lular i, fins i tot, cicle cel¬∑lular. Mutacions al gen d‚ÄôAIRE provoquen l‚Äôanomenada Poliendocrinopatia Autoimmune de tipus 1 (APS-1), malaltia autoimmune monog√®nica i poli-org√†nica, que cursa habitualment amb autoanticossos en sang i infiltrats limfocitaris a causa d‚Äôirregularitats al proc√©s de toler√†ncia central. Pr√®viament, el nostre grup va identificar difer√®ncies a nivell prote√≤mic en comparar c√®l¬∑lules que expressen AIRE amb d‚Äôaltres que no. Aquelles c√®l¬∑lules que expressaven AIRE, van presentar un augment en l‚Äôexpressi√≥ de prote√Įnes pro-apopt√≤tiques amb una conseg√ľent inducci√≥ de l‚Äôapoptosi, respecte de les c√®l¬∑lules control. Calcyclin-Binding Protein o SIAH1 Interacting Protein (CACYBP/SIP) va ser identificada com una de les prote√Įnes incrementades, la qual √©s una prote√Įna adaptadora que desenvolupa activitats relacionades amb degradaci√≥ via ubiquitina-proteasoma. A la seva seq√ľ√®ncia, es troba l‚Äôanomenat motiu d‚Äôinteracci√≥ amb Seven in Absentia Homolog 1 (SIAH1), una E3 ubiquitina lligasa de tipus RING. Aquesta fam√≠lia t√© dos membres catal√≠ticament funcionals: SIAH1 i SIAH2. Totes dues s√≥n regulades en resposta a diferents senyals: SIAH1 √©s expressada en resposta a dany genot√≤xic i, SIAH2, en resposta a hip√≤xia. Aquestes E3 ubiquitina lligases comparteixen alguns substrats espec√≠fics, part dels quals estan relacionats amb AIRE. Una an√†lisi de seq√ľ√®ncia proteica d‚ÄôAIRE va permetre identificar la pres√®ncia de dos motius d‚Äôinteracci√≥ amb SIAH1: un complet i un altre amb una mutaci√≥ conservadora. A aquesta tesi s‚Äôhan caracteritzat, mitjan√ßant t√®cniques bioqu√≠miques i prote√≤mica quantitativa, alguns aspectes relacionats amb la prote√Įna AIRE i l‚Äôefecte de la seva expressi√≥ a l√≠nies cel¬∑lulars que puguin permetre trobar-hi noves funcions de la prote√Įna. En primer lloc, s‚Äôhan comparat, per mitj√† de t√®cniques de prote√≤mica quantitativa (iTRAQ) i d‚Äôan√†lisi de repertoris de p√®ptids derivats d‚ÄôHLA-I, els proteomes i els peptidomes de c√®l¬∑lules que expressaven AIRE de manera diferencial, respectivament. Aquest tipus d‚Äôestudi no s‚Äôhavia realitzat fins ara. De manera addicional, s‚Äôhan mapejat els dominis d‚ÄôAIRE implicats en apoptosi. A m√©s, aquesta aproximaci√≥ ha perm√®s identificar la relaci√≥ de l‚Äôexpressi√≥ d‚ÄôAIRE amb un increment de la mobilitat cel¬∑lular. En segon lloc, s‚Äôha caracteritzat una nova localitzaci√≥ de la prote√Įna en c√®l¬∑lules post-mit√≤tiques, a prop del midbody. Tamb√© s‚Äôha aconseguit mostrar la localitzaci√≥ d‚ÄôAIRE durant tot el cicle cel¬∑lular i, m√©s concretament, a les diferents fases de la mitosi. En √ļltim lloc, s‚Äôha caracteritzat bioqu√≠micament i funcionalment la interacci√≥ entre AIRE i les E3 ubiquitina lligases de la fam√≠lia de SIAH, mostrant que AIRE interacciona amb SIAH1 i SIAH2 a trav√©s del primer motiu d‚Äôinteracci√≥. Aquesta interacci√≥ permet la ubiquitinaci√≥ d‚ÄôAIRE i la seva degradaci√≥. Aquest efecte √©s m√©s notori amb SIAH1.El timo es el √≥rgano donde se genera el repertorio de linfocitos T que circular√° por la periferia. Para que este repertorio sea inmunocompetente y m√≠nimamente autorreactivo se requiere una selecci√≥n exhaustiva en el timo. La tolerancia central evita en gran medida la maduraci√≥n de linfocitos T con potencial autorreactivo. Consiste en la eliminaci√≥n de timocitos autorreactivos durante la selecci√≥n t√≠mica a trav√©s de dos procesos: una selecci√≥n positiva en la corteza, donde sobrevivir√°n timocitos que logren reconocer mol√©culas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) propias asociados a p√©ptidos propios; y de una selecci√≥n negativa en la m√©dula, que eliminar√° aquellos que reconozcan complejos MHC-p√©ptido propios con alta afinidad. Para que la selecci√≥n negativa sea eficiente ser√° necesaria la expresi√≥n de todas las prote√≠nas presentes en el organismo. El Regulador Autoinmune (AIRE) es la prote√≠na encargada de dirigir gran parte de la expresi√≥n ect√≥pica de ant√≠genos restringidos a tejidos y √≥rganos (TRAs) por parte de las c√©lulas epiteliales t√≠micas medulares (mTECs), donde se expresa mayoritariamente. AIRE es una prote√≠na multidominio relacionada con la regulaci√≥n de la expresi√≥n y transcripci√≥n g√©nica, apoptosis, diferenciaci√≥n celular e incluso ciclo celular. Mutaciones en el gen de AIRE provocan la denominada Poliendocrinopat√≠a Autoinmune de tipo 1 (APS-1), enfermedad autoinmune monog√©nica y poliorg√°nica, cursando habitualmente con autoanticuerpos en sangre e infiltrados linfocitarios debido a irregularidades en el proceso de tolerancia central. En un trabajo previo de nuestro grupo se determinaron diferencias a nivel prote√≥mico comparando c√©lulas que expresaban AIRE con las que no. Aquellas c√©lulas que expresaban AIRE presentaban un aumento en la expresi√≥n de prote√≠nas pro-apopt√≥ticas con una consecuente inducci√≥n en la apoptosis respecto a las c√©lulas control, as√≠ como un incremento en prote√≠nas de tipo chaperona y una disminuci√≥n de prote√≠nas relacionadas con el citoesqueleto. Entre las prote√≠nas incrementadas se encontr√≥ la Calcyclin-Binding Protein o SIAH1-Interacting Protein (CACYBP/SIP). Es una prote√≠na adaptadora que contiene un motivo de uni√≥n a una E3 ubiquit√≠n ligasa, Seven In Absentia Homologe 1 (SIAH1). SIAH1 pertenece a una familia de E3 ubiquit√≠n ligasas de tipo RING. Posee tres miembros, dos de ellos catal√≠ticamente funcionales: SIAH1 y SIAH2 que presentan una elevada similitud de secuencia pero con actividades antag√≥nicas. SIAH1 es pro-apopt√≥tica y SIAH2 pro-oncog√©nica. Su regulaci√≥n est√° determinada en respuesta a se√Īales de da√Īo genot√≥xico e hipoxia, respectivamente. Ambas prote√≠nas comparten sustratos, presentando algunos de ellos relaci√≥n con la prote√≠na AIRE. Un an√°lisis de la secuencia proteica de AIRE permiti√≥ observar que la prote√≠na conten√≠a dos posibles motivos de uni√≥n a SIAH1, uno completo y otro con una mutaci√≥n conservadora. En la presente tesis se han caracterizado, mediante t√©cnicas bioqu√≠micas y de prote√≥mica cuantitativa, varios aspectos relacionados con AIRE y el efecto de su expresi√≥n en l√≠neas celulares, que han permitido encontrar nuevas posibles funciones de la prote√≠na: En primer lugar, se han comparado mediante t√©cnicas de prote√≥mica cuantitativa (iTRAQ) los proteomas de c√©lulas que expresaban AIRE de forma diferencial y se han comparado los peptidomas de HLA-I de las mismas c√©lulas, estudio que no se hab√≠a realizado hasta el momento. Adicionalmente se han mapeado los dominios de AIRE para inducir apoptosis. Finalmente, esta aproximaci√≥n ha permitido mostrar que AIRE induce un incremento en la movilidad celular. En segundo lugar, se ha caracterizado una nueva localizaci√≥n de la prote√≠na AIRE en c√©lulas post-mit√≥ticas, cerca del midbody. Asimismo, se ha logrado mostrar la localizaci√≥n de AIRE a lo largo del ciclo celular y, m√°s concretamente, en las diferentes fases de la mitosis; En √ļltimo lugar, se ha caracterizado bioqu√≠mica y funcionalmente la interacci√≥n entre AIRE, SIAH1 y SIAH2 a trav√©s del primer motivo de interacci√≥n, permitiendo su poli-ubiquitinaci√≥n y degradaci√≥n.The thymus is the organ where the repertoire of circulating T lymphocytes is generated. An exhaustive selection whitin the thymus is required in order to generate an immunocompetent T cell repertoire: broadly diverse for recognizing pathogens but minimally autoreactive. Central tolerance is based on the successfully maturation of T cells by an appropriate interaction with self Major Histocompatibility Complex (MHC)/peptide complexes. This process consists in a positive selection which takes place in the cortex and a negative selection carried out in the thymic medulla. In the cortex, only thymoctes carrying a functional TCR able to recognize self MHC molecules will survive. In the medulla, thymocytes that recognize self MHC/peptides complexes are eliminated. For negative selection to be efficient it will be necessary the expression of the whole proteome of the body. The Autoimmune Regulator (AIRE) leads the ectopic expression of antigens restricted to tissues and organs (TRAs) by medullary thymic epithelial cells (mTECs). AIRE is a multidomain protein related to the regulation of gene expression and transcription, apoptosis, cell differentiation and cell cycle. Mutations in AIRE gene cause the so-called Autoimmune Polyendocrinopathy type 1 (APS-1), a monogenic and polyorganic autoimmune disease, characterized by the presence of autoantibodies in the blood and lymphocytic infiltrates due to a defective central tolerance process Previous findings of our group showed differences between the proteomes of differentially AIRE expressing cells. AIRE+ cells increased the expression of chaperones and apoptosis-related proteins and dampened cytoskeleton-associated proteins compared to control cells. One of the increased proteins was Calcyclin-Binding Protein or SIAH1-Interacting Protein (CACYBP/SIP), an adaptor protein involved in ubiquitin-proteasome mediated protein degradation. SIP interacts with Seven in Absentia Homologue 1 (SIAH1) E3 ubiquitin ligase through the SIAH1 binding motif. SIAH1 and SIAH2 belongs to SIAH RING-type E3 ubiquitin ligase family. SIAH1 is expressed in response to genotoxic damage while SIAH2 is increased under hypoxia conditions. Both E3 ubiquitin ligases share specific targets, some of them related with AIRE. Protein sequence analysis showed the presence of two possible SIAH1 binding motifs in AIRE sequence: one with the complete sequence and the other with a conservative mutation. In this thesis, some aspects related to AIRE and the effect of its expression in cell lines have been characterized using biochemical and proteomics techniques, which may allow us to find new functions of the protein: First, using quantitative proteomics techniques (iTRAQ) and HLA-I derived peptides repertoire analysis the proteomes and the peptidomes of differentially AIRE expressing cells have been analyzed. A study that had not been carried out up to now. Additionally, the AIRE domains involved in apoptosis have been identify. Finally, this approach has allowed us to show that AIRE induces an increase in cell mobility. Second, a new localization of the AIRE protein has been characterized in post-mitotic cells, surrounding the midbody. Likewise, it has been possible to show the location of AIRE throughout the cell cycle and in different mitotic phases. Third the interaction between AIRE and the E3 ubiquitin ligases of the SIAH family has been biochemically and functionally characterized. AIRE interacts with SIAH1 and SIAH2 through the first interaction motif. SIAH1 leads to the polyubiquitination and degradation of AIRE. That effect is slightly observed in the case of SIAH2 although polyubiquitinated AIRE is also detected.Universitat Aut√≤noma de Barcelona. Programa de Doctorat en Immunologia Avan√ßad

    Understanding the intracellular mechanisms leading to motoneuron degeneration in spinal muscular atrophy disease

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    L‚ÄôAtr√≤fia Muscular Espinal (AME) √©s una malaltia neuromuscular degenerativa greu i la primera causa gen√®tica de mort infantil. L‚ÄôAME s‚Äôorigina per la p√®rdua o mutaci√≥ del gen Survival Motor Neuron 1 (SMN1) i la disminuci√≥ de la prote√Įna Survival Motor Neuron (SMN). Els nivells de SMN contribueixen en la determinaci√≥ del fenotip i la gravetat de la malaltia. Una duplicaci√≥ centrom√®rica d‚Äôaquest gen, SMN2, √©s la responsable de la producci√≥ de prote√Įna SMN en la condici√≥ d‚ÄôAME. La disminuci√≥ sist√®mica de SMN resulta en l‚Äôafectaci√≥ de diversos teixits i c√®l¬∑lules. Les motoneurones (MNs) de la medul¬∑la espinal son el tipus cel¬∑lular amb majors alteracions. Per desenvolupar noves estrat√®gies terap√®utiques que evitin la degeneraci√≥ de les MNs i la progressi√≥ de la malaltia, √©s necessari con√®ixer en profunditat els mecanismes cel¬∑lulars que s‚Äôhi troben implicats. L‚Äôobjectiu del present treball ha estat analitzar les alteracions de les vies de senyalitzaci√≥ de superviv√®ncia neuronal PI3K/Akt i ERK MAPK, aix√≠ com l‚Äôestudi de marcadors d‚Äôapoptosi i d‚Äôautof√†gia en diferents models d‚ÄôAME, centrant la investigaci√≥ en la implicaci√≥ d‚Äôaquestes modificacions en les MNs. Els resultats van mostrar que les MNs dels models d‚ÄôAME presentaven un increment en la degeneraci√≥ neur√≠tica, la disminuci√≥ de la superviv√®ncia cel¬∑lular, un augment del tall de la proteasa caspassa-3 i major pres√®ncia de nuclis amb morfologia apopt√≤tica. Les prote√Įnes antiapopt√≤tiques FAIM i XIAP estaven disminu√Įdes en extractes totals de medul¬∑la espinal de ratol√≠ d‚ÄôAME, tanmateix, en cultius de MNs es trobaven augmentades. Tot i aix√≠, la pres√®ncia de caspassa-3 activa i de nuclis fragmentats, indica que l‚Äôexpressi√≥ de FAIM-L i XIAP podria no ser suficient per contrarestar l‚Äôactivaci√≥ de l‚Äôapoptosi en MNs. Les vies de senyalitzaci√≥ intracel¬∑lular PI3K/Akt i ERK MAPK tamb√© estan alterades en les MNs AME. Es va observar una disminuci√≥ de la fosforilaci√≥ d‚ÄôAkt i un increment de la fosforilaci√≥ d‚ÄôERK. La inhibici√≥ d‚Äôaquestes vies en MNs va demostrar la seva implicaci√≥ en la regulaci√≥ transcripcional de SMN. Tot i aix√≠, la regulaci√≥ end√≤gena de SMN no va alterar la fosforilaci√≥ d‚ÄôAkt i ERK. L‚Äôestudi dels marcadors d‚Äôautof√†gia va revelar un perfil d‚Äôexpressi√≥ diferencial de les prote√Įnes analitzades entre els models cel¬∑lulars d‚ÄôAME. Aix√≠ doncs, mentre que en m√ļscul hi havia una disminuci√≥ de la formaci√≥ d‚Äôautofagosomes i un augment del flux d‚Äôautof√†gia, en les MNs s‚Äôobservava un increment d‚Äôautofagosomes i una disminuci√≥ del flux. A m√©s, les MNs AME presentaven un increment en la fosforilaci√≥ de la prote√Įna mTOR, la qual participa en la inhibici√≥ de l‚Äôautof√†gia. La fosforilaci√≥ de mTOR i els canvis dels indicadors de l‚Äôautof√†gia poden ser modulats per la inhibici√≥ farmacol√≤gica de la via ERK i per quelants de Ca2+ intracel¬∑lular. En conclusi√≥, els nostres resultats demostren alteracions en vies de superviv√®ncia intracel¬∑lular, en la senyalitzaci√≥ per Ca2+, i en els processos d‚Äôautof√†gia i apoptosi en les MNs AME. Les observacions d‚Äôaquest treball suggereixen una connexi√≥ entre els nivells de Ca2+ intracel¬∑lular i la disrupci√≥ de la via ERK MAPK, l‚Äôactivaci√≥ de la qual contribueix a la modificaci√≥ de l‚Äôautof√†gia en les MNs AME. La regulaci√≥ del Ca2+ intracel¬∑lular i de la via ERK MAPK podrien constituir dianes per restaurar els processos d‚Äôautof√†gia alterats en les MNs i ser considerades en el desenvolupament futur de noves ter√†pies combinades pel tractament de l‚ÄôAME.La Atrofia Muscular Espinal (AME) es una enfermedad neuromuscular degenerativa grave y la primera causa gen√©tica de muerte infantil. Se origina por la p√©rdida o mutaci√≥n del gen Survival Motor Neuron 1 (SMN1) y la disminuci√≥n de la prote√≠na Survival Motor Neuron (SMN). Los niveles de SMN contribuyen a la determinaci√≥n del fenotipo y la gravedad de la enfermedad. La duplicaci√≥n centrom√©rica de este gen, SMN2, es el responsable de la producci√≥n de prote√≠na SMN en la AME. La reducci√≥n sist√©mica de SMN resulta en la afectaci√≥n de varios tejidos y c√©lulas. Las motoneuronas (MNs) de la m√©dula espinal son el tipo celular con mayores alteraciones. Para desarrollar nuevas terapias que impidan la degeneraci√≥n de las MNs y la progresi√≥n de la enfermedad, es necesario conocer en profundidad los mecanismos celulares implicados en √©sta. El objetivo de √©ste trabajo ha sido analizar las alteraciones de las v√≠as de se√Īalizaci√≥n de supervivencia neuronal PI3K/Akt y ERK MAPK, as√≠ como el estudio de marcadores de apoptosis y de autofagia en diferentes modelos de AME, centrando la investigaci√≥n en la implicaci√≥n de estas modificaciones en las MNs. Los resultados mostraron que las MNs de los modelos de AME presentaban incremento en la degeneraci√≥n neur√≠tica, disminuci√≥n en la supervivencia celular, aumento del corte de la proteasa caspasa-3 y mayor presencia de n√ļcleos apopt√≥ticos. Las prote√≠nas antiapopt√≥ticas FAIM y XIAP estaban reducidas en extractos totales de m√©dula espinal de rat√≥n de AME, mientras que en cultivos de MNs se encontraban elevadas. Aun as√≠, la presencia de caspasa-3 activa y de n√ļcleos fragmentados indica que la expresi√≥n de FAIM-L y XIAP podr√≠a ser insuficiente para contrarrestar la activaci√≥n de la apoptosis en las MNs AME. Las v√≠as de se√Īalizaci√≥n PI3K/Akt y ERK MAPK tambi√©n est√°n alteradas en las MNs AME. Se observ√≥ una disminuci√≥n de la fosforilaci√≥n de Akt y un incremento de la fosforilaci√≥n de ERK. La inhibici√≥n de estas v√≠as en MNs demostr√≥ su implicaci√≥n en la regulaci√≥n transcripcional de SMN. No obstante, la regulaci√≥n end√≥gena de SMN no alter√≥ la fosforilaci√≥n de Akt y ERK. El estudio de los marcadores de autofagia revel√≥ una expresi√≥n diferencial de las prote√≠nas analizadas entre los modelos celulares de AME. Mientras que en m√ļsculo hab√≠a una disminuci√≥n de la formaci√≥n de autofagosomas y un aumento del flujo de autofagia, en las MNs se observaba un incremento de autofagosomas y una disminuci√≥n del flujo. Adem√°s, las MNs AME presentaban un incremento en la fosforilaci√≥n de la prote√≠na mTOR, la cual participa en la inhibici√≥n de la autofagia. La fosforilaci√≥n de mTOR y los cambios de los indicadores de la autofagia pueden ser modulados por la inhibici√≥n farmacol√≥gica de la v√≠a ERK y por quelantes de Ca2+ intracelular. En conclusi√≥n, nuestros resultados demuestran alteraciones en v√≠as de supervivencia intracelular, en la se√Īalizaci√≥n por Ca2+, y en los procesos de autofagia y apoptosis en las MNs AME. Las observaciones de este trabajo sugieren una conexi√≥n entre los niveles de Ca2+ intracelular y la disrupci√≥n de la v√≠a ERK MAPK, la activaci√≥n de la cual contribuye a la modificaci√≥n de la autofagia en las MNs AME. La regulaci√≥n del Ca2+ intracelular y de la v√≠a ERK MAPK podr√≠an constituir dianas para restaurar los procesos de autofagia alterados en las MNs y ser consideradas en el futuro desarrollo de nuevas terapias combinadas para el tratamiento de la AME.Spinal Muscular Atrophy (SMA) is a severe degenerative neuromuscular disease and the first genetic cause of infant death. SMA is caused by the loss or mutation of the Survival Motor Neuron 1 gene (SMN1) and the decrease of the Survival Motor Neuron (SMN) protein. SMN levels contribute to determining the disease phenotype and severity. A centromeric duplication of this gene, SMN2, is responsible for SMN protein production in SMA condition. The systemic decrease of SMN results in the alteration of various cells and tissues. Spinal cord motoneurons (MNs) are the cells with greatest dysregulations in SMA disease. To develop new therapeutic strategies for preventing MN degeneration and disease progression, studying the cellular and molecular mechanisms underlying the collapse of these cells is needed. The objectives of this work have been to analyze the alterations of the neuronal survival signaling pathways PI3K/Akt and ERK MAPK, as well as the study of apoptosis and autophagy markers in different SMA models, focusing the investigation on the involvement of these modifications in MNs. Results showed that mouse and human SMA MNs showed higher percentage of neurite degeneration, decreased cell survival, increased caspase-3 cleavage, and incremented presence of nuclei with apoptotic morphology. The antiapoptotic proteins FAIM-L and XIAP were reduced in total extracts of SMA spinal cord. Conversely, in cultured MNs they were increased. However, the presence of active caspase-3 and fragmented nuclei indicates that FAIM-L and XIAP expression may not be sufficient to counteract apoptosis activation in SMA MNs. The intracellular signaling pathways PI3K/Akt and ERK MAPK are also altered in SMA MNs. A decrease in Akt phosphorylation and an increase in ERK phosphorylation was observed. The inhibition of these pathways in MNs demonstrated their involvement in SMN protein transcription. However, SMN endogenous regulation did not alter Akt or ERK phosphorylation. The study of autophagy markers revealed a differential expression profile of the analyzed proteins between SMA cellular models. Hence, while in muscle there was a decrease in autophagosome formation and an increase in autophagic flux, in MNs there was an increase in autophagosomes and a decrease in flux. In addition, SMA MNs showed increased mTOR phosphorylation, a protein which participates in autophagy inhibition. mTOR phosphorylation and changes in autophagy markers can be modulated by ERK MAPK pathway pharmacological inhibition and intracellular Ca2+ chelators. In conclusion, our results demonstrate alterations in intracellular survival pathway, in Ca2+ signaling, and in autophagy and apoptosis processes in SMA MNs. This work‚Äôs observations suggest a connection between intracellular Ca2+ levels and the disruption of the ERK MAPK pathway, the activation of which contributes to the modification of autophagy in SMA MNs. Intracellular Ca2+ and ERK MAPK pathway regulation could constitute targets to restore altered autophagic processes in MNs and may be considered in the future development of new combined therapies for SMA treatment

    Ocena skutecznoŇõci pochodnych stilbenowych w uwraŇľliwianiu kom√≥rek raka piersi na dziaŇāanie promieniowania jonizujńÖcego

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    Rak piersi jest najczńôŇõciej diagnozowanym nowotworem u kobiet. W Polsce rocznie notuje sińô okoŇāo 19 tysińôcy nowych przypadk√≥w zachorowaŇĄ na ten typ nowotworu. Leczenie polega gŇā√≥wnie na chirurgicznym usunińôciu tkanki zmienionej nowotworowo, a nastńôpnie miejscowym zastosowaniu radioterapii. W wielu przypadkach np. gdy nowotw√≥r jest w zbyt zaawansowanym stadium, bńÖdŇļ stan og√≥lny pacjenta nie pozwala na wdroŇľenie innego leczenia, radioterapia jest jedynńÖ moŇľliwńÖ do zastosowania metodńÖ. Jednak radioterapia nie zawsze jest wystarczajńÖco efektywna. Wynika to gŇā√≥wnie z wrodzonej bńÖdŇļ nabytej radioopornoŇõńá kom√≥rek nowotworowych. Dlatego poszukuje sińô sposob√≥w, kt√≥re zwińôkszaŇāyby wraŇľliwoŇõńá kom√≥rek nowotworowych na dziaŇāanie promieniowania jonizujńÖcego, a jednoczeŇõnie chroniŇāyby kom√≥rki prawidŇāowe przed jego szkodliwym dziaŇāaniem. W tym aspekcie duŇľym zainteresowaniem cieszńÖ sińô niskoczńÖsteczkowe zwińÖzki pochodzenia naturalnego. Dane literaturowe wskazujńÖ, Ňľe niekt√≥re zwińÖzki z grupy polifenoli mogńÖ zwińôkszańá efekty cytotoksycznego dziaŇāania promieniowania jonizujńÖcego na szereg rodzaj√≥w kom√≥rek nowotworowych. StńÖd teŇľ celem badawczym pracy byŇāa ocena i por√≥wnanie dziaŇāania 3 zwińÖzk√≥w, pochodnych stilbenowych, w kombinacji z promieniowaniem jonizujńÖcym na kom√≥rki raka piersi. Badania wykonano na kom√≥rkach dw√≥ch linii raka piersi: estrogenozaleŇľnej linii MCF-7 oraz hormononiezaleŇľnej linii HCC38. Badanymi zwińÖzkami byŇāy resweratrol i dwa jego analogi: piceatannol oraz piceidu. W pracy oceniono cytotoksyczne wŇāaŇõciwoŇõci pochodnych stilbenowych w poŇāńÖczeniu z promieniowaniem jonizujńÖcym na wybrane kom√≥rki raka piersi. Oszacowano stopieŇĄ zaawansowania apoptozy oraz wskazano szlaki, kt√≥re uczestniczńÖ w jej indukcji. Sprawdzono takŇľe czy dochodzi do uruchomienia mechanizm√≥w antyoksydacyjnej odpowiedzi kom√≥rek na dziaŇāanie reaktywnych form tlenu generowanych radiacyjnie. Ponadto na podstawie poziomu ekspresji biaŇāka Rad51 i H2AX ustalono czy dochodzi do indukcji napraw uszkodzonego DNA. W pracy doktorskiej wykazano, Ňľe pochodne stilbenowe stosowane w niskich stńôŇľeniach (2,5 ‚Äď 5 M) nie wykazujńÖ cytotoksycznego dziaŇāania na kom√≥rki obu badanych linii. DziaŇāanie cytotoksyczne obserwowano przy wyŇľszych stńôŇľeniach badanych zwińÖzk√≥w. Kom√≥rki linii MCF- 7 byŇāy bardziej wraŇľliwe w por√≥wnaniu do kom√≥rek HCC38 zar√≥wno 8 na dziaŇāanie samych zwińÖzk√≥w jak i w poŇāńÖczeniu z promieniowaniem jonizujńÖcym. ZwińÖzane jest to ze sŇāabszńÖ aktywacjńÖ mechanizmu antyoksydacyjnej odpowiedzi oraz indukcjńÖ naprawy radiacyjnie uszkodzonego DNA w kom√≥rek MCF-7 niŇľ w kom√≥rkach HCC38. Proces apoptozy zar√≥wno w kom√≥rkach MCF-7 jaki w kom√≥rkach HCC38 aktywowany jest z udziaŇāem szlaku zewnńôtrznego jaki i szlaku wewnńôtrznego. Ponadto uzyskane wyniki wskazujńÖ, Ňľe w przypadku linii MCF-7 aktywacja programowanej Ňõmierci zachodzi niezaleŇľnie od biaŇāka p53. Uzyskane w pracy wyniki pozwalajńÖ jednoznacznie stwierdzińá, Ňľe spoŇõr√≥d badanych pochodnych stilbenowych najwińôksze radiouczulajńÖce wŇāaŇõciwoŇõci wykazuje resweratrol, nieco mniejsze piceatannol, natomiast najmniejszńÖ skutecznoŇõcińÖ charakteryzuje sińô piceid. Uzyskane w niniejszej pracy doktorskiej wyniki uzupeŇāniajńÖ i poszerzajńÖ dotychczasowy stan wiedzy dotyczńÖcy potencjalnego zastosowania pochodnych stilbenowych w charakterze radiouczulaczy w leczeniu raka piersi

    Papel de la familia de microRNAs-449 y el gen CDC20B en la respuesta a tratamientos en c√°ncer de mama: organoides y cultivos primarios como modelos tumorales

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    [ES] El c√°ncer de mama triple negativo representa el 10-20% de los casos de c√°ncer de mama. Este subtipo molecular se caracteriza por su gran agresividad y capacidad invasiva y se asocia a un mal pron√≥stico. La ausencia de receptores hormonales y de HER2 hace que la quimioterapia sea el principal tratamiento sist√©mico eficaz. Sin embargo, varias pacientes con c√°ncer de mama triple negativo recaen tras recibir quimioterapia. Por lo tanto, es crucial descifrar las caracter√≠sticas moleculares y buscar nuevas herramientas terap√©uticas para este subtipo. En este sentido, los microRNAs (miRNAs) est√°n desregulados en varios tipos de c√°ncer y emergen como potenciales mol√©culas pron√≥sticas implicadas en procesos biol√≥gicos y en la respuesta a la quimioterapia. Esta tesis titulada "Papel de los microRNAs-449 en las caracter√≠sticas del c√°ncer de mama: de la regulaci√≥n epigen√©tica a la resistencia a la quimioterapia" se centra en el papel de la familia miRNA-449 (miRNA-449a, miRNA-449b-5p y miRNA-449c-5p) en la modulaci√≥n de la agresividad del c√°ncer de mama y la respuesta a la quimioterapia. Este estudio aport√≥ pruebas de la regulaci√≥n a la baja de los miRNAs-449 en l√≠neas celulares de c√°ncer de mama triple negativo y en pacientes, y sugiri√≥ la desacetilaci√≥n de histonas de su regi√≥n promotora como mecanismo inhibidor. En particular, se observ√≥ que las histonas desacetilasas HDAC1 y SIRT1 estaban reguladas al alza en las c√©lulas de c√°ncer de mama triple negativo, y se sugiri√≥ su inhibici√≥n como mecanismo de inhibici√≥n. Los an√°lisis in silico se√Īalaron a ACSL4, una enzima activadora de √°cidos grasos, como diana de miARNs-449. Esto concuerda con otros estudios que se√Īalan una alteraci√≥n del metabolismo de los l√≠pidos como causa de la progresi√≥n del c√°ncer. Se observ√≥ una correlaci√≥n inversa entre los miRNA-449 y la expresi√≥n de ACSL4 en l√≠neas celulares de c√°ncer de mama triple negativo y en pacientes, y el ensayo de reportero de luciferasa confirm√≥ por primera vez esta diana directa de ACSL4 por los miRNA-449a y miRNA-449b-5p. Adem√°s, la sobreexpresi√≥n del microRNA-449c-5p por s√≠ sola tambi√©n produjo una regulaci√≥n a la baja de ACSL4, por lo que tambi√©n se sugiri√≥ una relaci√≥n indirecta a trav√©s de la modulaci√≥n de mol√©culas desconocidas. La sobreexpresi√≥n de miRNAs-449 y la infraexpresi√≥n de ACSL4 inhibieron la proliferaci√≥n celular, la migraci√≥n al disminuir la capacidad de sufrir el proceso de transici√≥n epitelial-mesenquimal, y la formaci√≥n de colonias al regular a la baja los marcadores de troncalidad. Estos resultados sugieren una inhibici√≥n miRNAs-449 de la agresividad del c√°ncer de mama a trav√©s de la regulaci√≥n a la baja de ACSL4. Adem√°s, bas√°ndonos en la literatura previa y en los resultados publicados por nuestro laboratorio, se evalu√≥ la implicaci√≥n de los miRNAs-449 en la respuesta a la quimioterapia a trav√©s de esta nueva diana. Los miRNAs-449 fueron regulados a la baja en las c√©lulas resistentes a la doxorrubicina. A su vez, se observ√≥ una sobreexpresi√≥n de ACSL4 en c√©lulas resistentes a la doxorrubicina y en pacientes que recayeron tras un tratamiento con quimioterapia. El tratamiento posterior con doxorrubicina aument√≥ la expresi√≥n de miRNAs-449 pero disminuy√≥ la de ACSL4 en las c√©lulas sensibles a la doxorrubicina, pero no en las resistentes, sugiriendo as√≠ una implicaci√≥n de miRNAs-449 y ACSL4 en la respuesta a la quimioterapia. En este estudio, observamos que la sobreexpresi√≥n de miRNAs-449 produc√≠a sensibilidad a la doxorrubicina a trav√©s de la regulaci√≥n a la baja de ACSL4 mediante ensayos de viabilidad y apoptosis. Adem√°s, la inhibici√≥n de ACSL4 disminuy√≥ la expresi√≥n de la bomba de extrusi√≥n de f√°rmacos ABCG2, lo que condujo a un aumento de la acumulaci√≥n de doxorrubicina en las c√©lulas. La implicaci√≥n del miRNAs-449 en la inhibici√≥n de la agresividad y la sensibilidad a la doxorrubicina sugiere su potencial uso como herramienta terap√©utica en el c√°ncer de mama triple negativo.[CA] El c√†ncer de mama triple negatiu representa el 10-20% dels casos de c√†ncer de mama. Aquest subtipus molecular es caracteritza per la seua gran agressivitat i capacitat invasiva i s'associa a un mal pron√≤stic. L'abs√®ncia de receptors hormonals i d'HER2 fa que la quimioter√†pia siga el principal tractament sist√®mic efica√ß. No obstant aix√≤, diverses pacients amb c√†ncer de mama triple negatiu recauen despr√©s de rebre quimioter√†pia. Per tant, √©s crucial desxifrar les caracter√≠stiques moleculars i buscar noves eines terap√®utiques per a aquest subtipus. En aquest sentit, els microRNAs (miRNAs) estan desregulats en diversos tipus de c√†ncer i emergeixen com a potencials mol√®cules pron√≥sticas implicades en processos biol√≤gics i en la resposta a la quimioter√†pia. Aquesta tesi titulada "Paper dels microRNAs-449 en les caracter√≠stiques del c√†ncer de mama: de la regulaci√≥ epigen√®tica a la resist√®ncia a la quimioter√†pia" se centra en el paper de la fam√≠lia miRNA-449 (miRNA-449a, miRNA-449b-5p i miRNA-449c-5p) en la modulaci√≥ de l'agressivitat del c√†ncer de mama i la resposta a la quimioter√†pia. Aquest estudi va aportar proves de la regulaci√≥ a la baixa dels miRNAs-449 en l√≠nies cel¬∑lulars de c√†ncer de mama triple negatiu i en pacients, i va suggerir la *desacetilaci√≥n d'histones de la seua regi√≥ promotora com a mecanisme inhibidor. En particular, es va observar que les histones desacetilasas HDAC1 i SIRT1 estaven regulades a l'al√ßa en les c√®l¬∑lules de c√†ncer de mama triple negatiu, i es va suggerir la seua inhibici√≥ com a mecanisme d'inhibici√≥. Les an√†lisis in silico van assenyalar a ACSL4, un enzim activador d'√†cids grassos, com a diana de miARNs-449. Aix√≤ concorda amb altres estudis que assenyalen una alteraci√≥ del metabolisme dels l√≠pids com a causa de la progressi√≥ del c√†ncer. Es va observar una correlaci√≥ inversa entre els miRNA-449 i l'expressi√≥ d'ACSL4 en l√≠nies cel¬∑lulars de c√†ncer de mama triple negatiu i en pacients, i l'assaig de reporter de luciferasa va confirmar per primera vegada aquesta diana directa d'ACSL4 pels miRNA-449a i miRNA-449b-5p. A m√©s, la sobreexpressi√≥ del miRNA-449c-5p per si sola tamb√© va produir una regulaci√≥ a la baixa d'ACSL4, per la qual cosa tamb√© es va suggerir una relaci√≥ indirecta a trav√©s de la modulaci√≥ de mol√®cules desconegudes. La sobreexpressi√≥ de miRNAs-449 i la infraexpressi√≥ d'ACSL4 van inhibir la proliferaci√≥ cel¬∑lular, la migraci√≥ en disminuir la capacitat de patir el proc√©s de transici√≥ epitelial-mesenquimal, i la formaci√≥ de col√≤nies en regular a la baixa els marcadors de troncalitat. Aquests resultats suggereixen una inhibici√≥ de l'agressivitat del c√†ncer de mama a trav√©s de la regulaci√≥ a la baixa d'ACSL4. A m√©s, basant-nos en la literatura pr√®via i en els resultats publicats pel nostre laboratori, es va avaluar la implicaci√≥ dels miRNAs-449 en la resposta a la quimioter√†pia a trav√©s d'aquesta nova diana. Els miRNAs-449 van ser regulats a la baixa en les c√®l¬∑lules resistents a la doxorubicina. Al seu torn, es va observar una sobreexpressi√≥ d'ACSL4 en c√®l¬∑lules resistents a la doxorubicina i en pacients que van recaure despr√©s d'un tractament amb quimioter√†pia. El tractament posterior amb doxorubicina va augmentar l'expressi√≥ de micRNAs-449 per√≤ va disminuir la d'ACSL4 en les c√®l¬∑lules sensibles a la doxorubicina, per√≤ no en les resistents, suggerint aix√≠ una implicaci√≥ dels miRNAs-449 i ACSL4 en la resposta a la quimioter√†pia. En aquest estudi, observem que la sobreexpressi√≥ dels miRNAs-449 produ√Įa sensibilitat a la doxorubicina a trav√©s de la regulaci√≥ a la baixa d'ACSL4 mitjan√ßant assajos de viabilitat i apoptosi. A m√©s, la inhibici√≥ d'ACSL4 va disminuir l'expressi√≥ de la bomba d'extrusi√≥ de f√†rmacs ABCG2, la qual cosa va conduir a un augment de l'acumulaci√≥ de doxorubicina en les c√®l¬∑lules. La implicaci√≥ dels miRNAs-449 en la inhibici√≥ de l'agressivitat i la sensibilitat a la doxorubicina suggereix el seu potencial √ļs com a eina terap√®utica en el c√†ncer de mama triple negatiu.[EN] Triple-negative breast cancer accounts for 10-20% of breast cancer cases. This molecular subtype is characterized by its highly aggressive and invasive capacity being associated with a bad prognosis. The lack of hormone and HER2 receptors makes chemotherapy the main systemic effective treatment. However, several triple-negative breast cancer patients relapse after receiving chemotherapy. Therefore, deciphering the molecular characteristics and searching for new therapeutic tools for this subtype is crucial. In this sense, microRNAs (miRNAs) are found dysregulated in several cancer types and emerge as potential prognostic molecules involved in biological processes and chemotherapy response. This thesis entitled "Role of microRNAs-449 in breast cancer features: From epigenetic regulation to chemotherapy resistance" is focused on the role of the miRNA-449 (miRNA-449a, miRNA-449b-5p, and miRNA-449c-5p) family in the modulation of breast cancer aggressiveness and chemotherapy response. This study provided evidence of microRNAs-449 downregulation in triple-negative breast cancer cell lines and patients and suggested histone deacetylation of its promoter region as an inhibitor mechanism. Particularly, the histone deacetylases HDAC1 and SIRT1 were found upregulated in triple-negative breast cancer cells, and their genetic and chemical inhibition increased microRNAs-449 expression. In addition, a negative feedback loop modulation between miRNAs-449 and HDAC1/SIRT1 was observed, thus contributing to the homeostasis or tumoral phenotype of cells. In silico analyses pointed out ACSL4, a fatty acid-activating enzyme, as target of miRNAs-449. This is in concordance with other studies that pointed out an altered lipid metabolism to sustain cancer progression. An inverse correlation between microRNAs-449 and ACSL4 expression was observed in triple-negative breast cancer cell lines and patients, and luciferase reporter assay confirmed this ACSL4 direct targeting by miRNA-449a and miRNA-449b-5p for the first time. Moreover, the microRNA-449c-5p overexpression alone also produced an ACSL4 downregulation, so an indirect relationship was also suggested through the modulation of unknown molecules. MiRNAs-449 overexpression and ACSL4 knockdown inhibited cell proliferation, migration by diminishing the ability to undergo the epithelial-mesenchymal transition process, and colony formation by downregulating markers of stemness. These results suggested a microRNAs-449 inhibition of breast cancer aggressiveness through ACSL4 downregulation. Furthermore, based on previous literature and published results by our laboratory, a miRNAs-449 implication in chemotherapy response was evaluated through this novel target. MiRNAs-449 were downregulated in doxorubicin-resistant cells. In turn, ACSL4 overexpression was observed in doxorubicin-resistant cells and patients who relapsed after chemotherapy-containing treatment. Subsequent doxorubicin treatment increased miRNAs-449 but decreased ACSL4 expression in doxorubicin-sensitive, but not in resistant cells, thus suggesting a miRNAs-449 and ACSL4 implication in chemotherapy response. In this study, we observed that miRNAs-449 overexpression produced doxorubicin sensitivity through ACSL4 downregulation by viability and apoptosis assay. In addition, ACSL4 inhibition decreased the drug extrusion pump ABCG2's expression, leading to an increased doxorubicin accumulation in cells. The involvement of miRNAs-449 in the inhibition of aggressiveness and sensitivity to doxorubicin suggests its potential use as a therapeutic tool in triple-negative breast cancer.Torres Ruiz, S. (2023). Papel de la familia de microRNAs-449 y el gen CDC20B en la respuesta a tratamientos en c√°ncer de mama: organoides y cultivos primarios como modelos tumorales [Tesis doctoral]. Universitat Polit√®cnica de Val√®ncia. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/19884

    Studi in vitro e in vivo delle proprietà anti-invecchiamento di molecole degli agrumi e coinvolgimento di SIRT1 nell'aging cellulare e cerebrale.

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    Negli ultimi anni l‚Äôinvecchiamento √® diventato oggetto di numerosi studi volti ad indagare i meccanismi biochimici e fisiologici coinvolti nelle trasformazioni cellulari e tissutali, in modo da poter elaborare strategie utili alla prevenzione delle patologie ad esso correlate. La World Health Organization (WHO) ha stimato che la percentuale di popolazione di et√† superiore ai 65 anni cresce pi√Ļ rapidamente rispetto alle altre. Ci√≤ √® dovuto ad un miglioramento della qualit√† della vita, che conduce, anno dopo anno, ad un aumento delle aspettative di vita, non accompagnato per√≤, da un aumento delle nascite. √ą stato stimato, infatti, che nel 2050 gli ultrasessantenni saranno quasi 2 miliardi e rappresenteranno circa un quarto della popolazione mondiale. L‚Äôinvecchiamento √® un fenomeno fisiologico durante il quale si verifica una progressiva perdita delle funzionalit√† cellulari e tissutali, con una ridotta capacit√† di adattamento allo stress e di mantenimento dell‚Äôomeostasi. Il fenomeno dell‚Äôinvecchiamento porta, quindi, ad una maggior predisposizione allo sviluppo di malattie cronico-degenerative quali quelle neurodegenerative, cardiovascolari, polmonari e tumorali. La senescenza cellulare √® un processo che annovera molti fattori di natura biochimica, come ad esempio, l‚Äôinstabilit√† genomica, la disfunzione mitocondriale, l‚Äôaumento dei livelli di radicali liberi e le alterazioni epigenetiche. Numerosi studi sono stati condotti sull‚Äôinvecchiamento cellulare e cerebrale. In questo lavoro di tesi √® stato valutato il ruolo di molecole antiossidanti e di molecole inibitrici dell‚Äôenzima Sirtuin 1 (SIRT1) nel processo di invecchiamento, sia in vitro che in vivo. Per lo studio in vitro, le cellule H9c2 (cardiomioblasti embrionali murini) sono state trattate secondo un protocollo di induzione di senescenza da H2O2 e trattate successivamente con Sirtinolo (SIR), inibitore di SIRT1, e confrontate con analoghe cellule trattate, invece, con molecole con attivit√† antiossidante gi√† nota quali Naringenina (NAR), flavanone estratto dal Bergamotto (Citrus bergamia Risso et Poiteau) e Resveratrolo (RES). L‚Äôattivit√† pro-invecchiamento del Sirtinolo √® stata valutata anche tramite co-trattamenti NAR-SIR e RES-SIR. Per lo studio in vivo, sono state esaminate le propriet√† anti-invecchiamento a livello cerebrale del succo di Bergamotto, quantificando la variazione nell‚Äôespressione di geni rilevanti nei processi di senescenza. In particolare, √® stato scelto il frutto del genere ‚ÄúFantastico‚ÄĚ che ha dimostrato avere efficacia nutraceutica in studi precedenti. Il succo √® stato solubilizzato in acqua e fatto assumere dai topi continuativamente per 3 mesi, nell‚Äôarco di 12 mesi, al termine dei quali sono stati sacrificati ed √® stato eseguito l‚Äôespianto del cervello. L‚ÄôRNA √® stato, quindi, estratto dal tessuto cerebrale, retrotrascritto e amplificato tramite la tecnica della Real Time PCR. In particolar modo, lo studio √® stato indirizzato alla quantificazione dell‚Äôespressione dei geni SIRT1, HO-1 e NQO1, in quanto coinvolti nei processi di invecchiamento, apoptosi e ossidazione. √ą stata inoltre condotta un‚Äôanalisi di correlazione tra l‚Äôespressione genica a livello cerebrale e il fisiologico invecchiamento dell‚Äôanimale, per valutare se il trattamento con succo di Bergamotto fosse in grado di contrastare tale andamento. I risultati hanno evidenziato che l‚Äôinibizione della proteina SIRT1 nelle cellule determina un avanzamento dello stato di senescenza, contrariamente ai trattamenti con RES e NAR. Per quanto riguarda i risultati ottenuti dall‚Äôanalisi dell‚Äôespressione genica su tessuto cerebrale, √® stato osservato un aumento significativo dell‚Äôespressione di SIRT1, HO-1 e NQO1 nei topi trattati con il succo di Bergamotto, rispetto a quelli alimentati con il solo veicolo. In conclusione, questi risultati evidenziano un potenziale ruolo di SIRT1 nei processi di senescenza, suggerendo un effetto complessivo di anti-invecchiamento dei derivati degli agrumi che potrebbero essere usati come co-adiuvanti in strategie anti-aging

    Microfluidic-assisted ZIF-silk-polydopamine nanoparticles as promising drug carriers for breast cancer therapy

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    Metal‚Äďorganic frameworks (MOFs) are heralded as potential nanoplatforms for biomedical applications. Zeolitic imidazolate framework-8 (ZIF-8), as one of the most well known MOFs, has been widely applied as a drug delivery carrier for cancer therapy. However, the application of ZIF-8 nanoparticles as a therapeutic agent has been hindered by the challenge of how to control the release behaviour of anti-cancer zinc ions to cancer cells. In this paper, we designed microfluidic-assisted core-shell ZIF-8 nanoparticles modified with silk fibroin (SF) and polydopamine (PDA) for sustained release of zinc ions and curcumin (CUR) and tested these in vitro in various human breast cancer cells. We report that microfluidic rapid mixing is an efficient method to precisely control the proportion of ZIF-8, SF, PDA, and CUR in the nanoparticles by simply adjusting total flow rates (from 1 to 50 mL/min) and flow rate ratios. Owing to sufficient and rapid mixing during microfluidic-assisted nanoprecipitation, our designer CUR@ZIF-SF-PDA nanoparticles had a desired particle size of 170 nm with a narrow size distribution (PDI: 0.08), which is much smaller than nanoparticles produced using traditional magnetic stirrer mixing method (over 1000 nm). Moreover, a properly coated SF layer successfully enhanced the capability of ZIF-8 as a reservoir of zinc ions. Meanwhile, the self-etching reaction between ZIF-8 and PDA naturally induced a pH-responsive release of zinc ions and CUR to a therapeutic level in the MDA-MB-231, SK-BR-3, and MCF-7 breast cancer cell lines, resulting in a high cellular uptake efficiency, cytotoxicity, and cell cycle arrest. More importantly, the high biocompatibility of designed CUR@ZIF-SF-PDA nanoparticles remained low in cytotoxicity on AD-293 non-cancer cells. We demonstrate the potential of prepared CUR@ZIF-SF-PDA nanoparticles as promising carriers for the controlled release of CUR and zinc ions in breast cancer therapy

    Specificity, efficacy, and adaptive responses mediated by TP53 oncosuppressor mutations of Mitochondrial Complex I inhibitors in personalized cancer therapy: from molecular mechanisms to the development of advanced preclinical models

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    L'inibizione del complesso respiratorio I (CI) √® una strategia antitumorale emergente, sebbene la specificit√† e l‚Äôefficacia di nuovi farmaci restino poco investigate. La generazione di modelli cellulari tumorali nulli per il CI rivela la specificit√† di EVP 4593 e BAY 872243 nell‚Äôindurre gli effetti antiproliferativi non associati all‚Äôapoptosi, selettivamente via CI, riducendo eventuali effetti collaterali. Studi preliminari in vivo evidenziano un rallentamento della crescita tumorale negli animali trattati con EVP 4593, il quale emerge come l‚Äôinibitore pi√Ļ potente. Per il suo ruolo nella riprogrammazione metabolica, e la sua elevata frequenza di mutazioni nelle neoplasie umane, sono stati investigati i potenziali meccanismi di adattamento alla terapia anti-CI sulla base dello stato mutazionale di TP53. L‚Äôauxotrofia da aspartato, un hallmark metabolico delle cellule tumorali con un danno al CI, causa un blocco della sintesi proteica mTORC1-dipendente nelle linee cellulari con una p53 mutata o nulla, inducendo un collasso metabolico. Viceversa, l'attivazione del sensore energetico AMPK promuove un recupero parziale della sintesi di aspartato in linee cellulari con la forma wild type di P53, che √® in grado di sostenere una migliore anaplerosi attraverso SCO2, fattore di assemblaggio del complesso respiratorio IV. Al fine di traslare questi risultati in un modello preclinico, si √® ottimizzato l‚Äôottenimento di colture di tumori umani espiantati tramite il bioreattore U-CUP. Il modello scelto √® stato quello di carcinoma sieroso ad alto grado dell‚Äôovaio (HGSOC), a partire da tessuto congelato, per l‚Äôelevata frequenza di mutazioni driver in TP53. I tessuti congelati preservano l'eterogeneit√† delle componenti cellulari del tessuto di origine e sono caratterizzati da cellule in attiva proliferazione senza attivazione di apoptosi. Dati preliminari mostrano un trend di riduzione dell‚Äôarea tumorale nei tessuti trattati con EVP 4593 e supportano l‚Äôutilizzo del modello preclinico nello studio di nuovi inibitori del CI sfruttando materiale primario di pazienti oncologici.Inhibition of respiratory complex I (CI) is an emerging anticancer strategy, whose specificity and efficacy of numerous inhibitors remain however elusive. Cancer cell models lacking CI reveal the specificity of EVP 4593 and BAY 872243 in inducing antiproliferative effects not associated with apoptosis, selectively via CI, reducing possible side effects. Preliminary in vivo studies show a slowing of tumor growth in animals treated with EVP 4593, which emerges as the most potent inhibitor. Because of its role in metabolic reprogramming, and its high mutation frequency in human malignancies, potential mechanisms of adaptation to anti-CI therapy based on TP53 mutational status have been investigated. Auxotrophy by aspartate, a metabolic hallmark of tumor cells with CI damage, causes a blockade of mTORC1-dependent protein synthesis in cell lines with mutated or null p53, inducing metabolic collapse. Conversely, activation of the energy sensor AMPK promotes partial recovery of aspartate synthesis in cell lines with the wild-type P53, which is able to sustain enhanced anaplerosis through SCO2, an assembly factor of respiratory complex IV. In order to translate these results into a preclinical model, cultures of explanted human tumors were optimized using the U-CUP bioreactor. The model chosen was high-grade serous ovarian cancer (HGSOC), from frozen tissue, because of the high frequency of driver mutations in TP53. Frozen tissues preserve the heterogeneity of cellular components of the tissue of origin and they are characterized by actively proliferating cells without activation of apoptosis. Preliminary data show a trend of tumor area reduction in EVP 4593-treated tissues and support the use of the preclinical model in the study of novel CI inhibitors by exploiting primary tissue from cancer patients

    A hotspot for posttranslational modifications on the androgen receptor dimer interface drives pathology and anti-androgen resistance

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    [eng] Nuclear receptors (NRs) are a superfamily of ligand-activated transcription factors that function as biological sensors to regulate gene expression in a timeand tissue-specific and manner. The coordinated actions of NRs affect the proliferation, differentiation, and apoptosis of different cell types. This thesis unravels new structural and functional information regarding the implications for human pathophysiology of two evolutionary highly related members of this superfamily that are regulated by steroid hormones, the androgen (AR) and glucocorticoid (GR) receptors. The AR directs male development, phenotype maintenance and adult physiology and reproduction. AR mutations associated with prostate cancer and androgen insensitivity syndromes may profoundly influence its structure, protein interaction network, and binding to chromatin, resulting in altered transcription signatures and drug responses. Current structural information fails to explain the effect of pathological mutations on AR structured function relationship. In this thesis dissertation, we have thoroughly studied the effects of five selected mutations that span the complete dimer interface of AR ligand binding domain (AR-LBD) using X-ray crystallography in combination with in vitro, in silico, and cell-based assays. These variants alter AR-dependent transcription and responses to antiandrogens by inducing a previously undescribed allosteric switch in the AR-LBD that increases exposure of a major methylation target, Arg761. We also corroborate the relevance of residues Arg761 and Tyr764 for AR dimerization and function. Together, our results reveal allosteric coupling of AR dimerization and posttranslational modifications as a disease mechanism with relevant implications for precision medicine. The GR is a ubiquitously expressed protein that controls metabolic and homeostatic processes essential for life. Although numerous crystal structures of the GR ligand-binding domain (GR-LBD) have been previously reported, the functional, (patho)-physiologically relevant oligomeric state of the full-length receptor (FL-GR) remains disputed. We have recently presented a catalogue of 20 different dimeric arrangements of the GR-LBD, including both transcriptionally active and self-repressed, antagonistic bound GR-LBD homodimers, with important implications for FL-GR multimerization in living cells. In this thesis, we go further and present evidence of the heterodimerization of AR and GR, a complex that has been hypothesized to have important implications in the pathophysiology of castration-resistant prostate cancer.[cat] Els receptors nuclears (NR) s√≥n una superfam√≠lia de factors de transcripci√≥ activats per lligands que funcionen com a sensors biol√≤gics per regular l'expressi√≥ g√®nica de manera espec√≠fica en temps i teixit. Les accions coordinades dels NR afecten la proliferaci√≥, diferenciaci√≥ i apoptosi de diferents tipus cel¬∑lulars. Aquesta tesi aporta nova informaci√≥ estructural i funcional sobre les implicacions en la fisiopatologia humana de dos receptors d'aquesta superfam√≠lia, estretament relacionats evolutivament, que estan regulats per hormones esteroides, els andr√≤gens (AR) i els de glucocorticoides (GR). L'AR dirigeix el desenvolupament i manteniment del fenotip mascul√≠, aix√≠ com la fisiologia i la reproducci√≥ en l'adultesa. Les mutacions a l'AR associades al c√†ncer de pr√≤stata i a la s√≠ndrome d'insensibilitat als andr√≤gens poden afectar la seva estructura, xarxa d'interacci√≥ de prote√Įnes i uni√≥ a la cromatina, resultant en l'alteraci√≥ del patr√≥ de transcripci√≥ de l'AR i de la resposta cel¬∑lular a f√†rmacs. La informaci√≥ estructural actual no explica l'efecte de les mutacions patol√≤giques en l'estructura-funci√≥ de l'AR. En aquesta tesi, hem estudiat a fons els efectes de cinc mutacions de la interf√≠cie de dimeritzaci√≥ del domini d'uni√≥ a lligand de l'AR (AR-LBD) utilitzant cristal¬∑lografia de raigs X en combinaci√≥ amb assajos in vitro, in silico i en c√®l¬∑lules. Aquestes variants alteren la transcripci√≥ dependent d'AR i la resposta als anti-andr√≤gens mitjan√ßant un canvi al¬∑lost√®ric pr√®viament desconegut en l'AR-LBD que augmenta l'exposici√≥ d'un important lloc de metilaci√≥, la Arg761. Tamb√© corroborem la rellev√†ncia dels residus Arg761 i Tyr764 per a la dimeritzaci√≥ i funci√≥ de l'AR. En conjunt, els nostres resultats mostren la comunicaci√≥ al¬∑lost√®rica entre dimeritzaci√≥ i modificaci√≥ posttraduccional de l'AR com a mecanisme patog√®nic amb implicacions rellevants pels f√†rmacs de precisi√≥. El GR √©s una prote√Įna expressada de manera ubiqua que controla processos metab√≤lics i homeost√†tics essencials per la vida. Tot i que s'han reportat nombroses estructures cristal¬∑logr√†fiques del GR-LBD, l'estat oligom√®ric funcional i fisiol√≤gicament rellevant del receptor complert (FL-GR) segueix sent objecte de disputa. Recentment hem presentat un cat√†leg de 20 disposicions dim√®riques diferents del GR-LBD, incloent tant aquelles transcripcionalment actives com auto-reprimides, amb implicacions importants per la oligomeritzaci√≥ de FL-GR en c√®l¬∑lules vives. En aquesta tesi, anem m√©s enll√† i presentem evid√®ncia de la heterodimeritzaci√≥ de l'AR i el GR, un complex que es proposa que t√© importants efectes en la fisiopatologia del c√†ncer de pr√≤stata resistent a la castraci√≥
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