Konventionalistische Ansätze in der Unternehmens­forschung

Das Forschungsprogramm der Économie des conventions (»Ökonomie der Konventionen«, im Folgenden kurz: EC) hat sich im Überschneidungsbereich verschiedener Fächer und Forschungs­ein­richtungen entwickelt. Ökonomen mit einem Interesse an der Entwicklung eines realistischen Zugangs zu rationalem Verhalten in Organisationen haben sich zusammen mit Spezialisten aus anderen Disziplinen wie der Soziologie, der Philosophie, der Rechtswissenschaft und dem Management an die Erforschung von Formen der Ko..

Konventionalistische Ansätze in der Unternehmens­forschung

Das Forschungsprogramm der Économie des conventions (»Ökonomie der Konventionen«, im Folgenden kurz: EC) hat sich im Überschneidungsbereich verschiedener Fächer und Forschungs­ein­richtungen entwickelt. Ökonomen mit einem Interesse an der Entwicklung eines realistischen Zugangs zu rationalem Verhalten in Organisationen haben sich zusammen mit Spezialisten aus anderen Disziplinen wie der Soziologie, der Philosophie, der Rechtswissenschaft und dem Management an die Erforschung von Formen der Ko..

Erweiterung und Automatisierung eines hefebasierten Reportergen-Testsystems zur Detektion toxischer Potentiale

Thema der vorliegenden Arbeit ist die Erweiterung und Automatisierung eines hefebasierten Reportergen-Testsystems zur Detektion toxischer Wirkungen. Die breite Erfassung biologischer und toxischer Wirkungen von Substanzen ist eine wichtige Aufgabe bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe. Neben der Bestätigung vorhergesagter Wirkmechanismen ist hier vor allem die Abschätzung des toxischen Potentials von zentraler Bedeutung, um mögliche Risiken erfassen zu können. Bereits in frühen Phasen der Wirkstoffentwicklung werden daher biologische Testverfahren benötigt, die mit geringen Kosten im Hochdurchsatz gefahren werden können. Diese müssen zuverlässige Ergebnisse liefern und sollten einen Rückschluß auf mögliche Wirkungen am Menschen ermöglichen,und den Ergebnissen von humanen Zellkulturuntersuchungen entsprechen. Ein solches Testsystem zur Detektion toxischer Potentiale im 96-well-Microplattenformat stellt das im Jahr 2000 von Afanassiev und Kollegen vorgestellte hefebasierte Reportergen-Testsystem dar. Auf Grund der Auswahl der Promotoren für das Reportergen-Plasmid von Genen, die durch DNA-Schäden induziert werden, ist dieses spezifisch für die Detektion genotoxischer Wirkungen geeignet. Um ein umfassenderes Bild der zellulären Wirkungen von Substanzen aufzuzeigen, wurden im Rahmen der Arbeit weitere Teststämme mit Promotoren anderer Spezifizität entwickelt. Eine weitere zentrale Aufgabe war die Etablierung und Optimierung des Testsystems auf einem Liquid-Handling-System zur automatisierten Durchführung von Substanztests im Hochdurchsatz. Ein erster Schritt für die Erweiterung des Testsystems war eine Umstellung vom 96-well-Microplatten-Format des bestehenden Tests auf das 384-well-Microplatten-Format. Dadurch konnten die für die Analyse erforderlichen Volumina um 60% reduziert werden, die erforderlichen Substanzmengen reduziert und die Anzahl der parallelen Messungen signifikant erhöht werden, bei gleichzeitiger Verringerung der Kosten um ca. 70%. Für die Etablierung neuer Reportergenkonstrukte und Teststämme wurden neue Gene / Promotoren zur Erweiterung des Testsystems durch Datenbank- und Literaturrecherche gesucht. Die Promotoren der ausgewählten Gene wurden mittels PCR aus genomischer DNA amplifiziert und durch molekulares Klonieren die entsprechenden Reportergen-Plasmide hergestellt. Diese wurden für die Transformation von Hefezellen (S. cerevisiae, FF18984) zur Herstellung von Reportergenstämmen genutzt. Ausgewählte Klone wurden mit Standardsubstanzen getestet und als Reportergenstämme für weitere Untersuchungen genutzt. Um dem wachsenden Umfang des Testsystems gerecht zu werden, wurde für Durchführung der experimentellen Untersuchungen die Nutzung eines Liquid-Handling-System notwendig. Dadurch konnte ein hoher Probendurchsatz bei großer Reproduzierbarkeit erreicht werden. Mit dem erweiterten hefebasierten Reportergen-Testsystem können Muster für die Proliferationshemmung und Promotor-Induktion der untersuchten Substanzen erstellt werden.Durch den Vergleich dieser Muster kann von Substanzen mit bekanntem, toxischem Potential auf das toxische Potential bislang nicht charakterisierter Substanzen geschlossen werden.In ersten Substanztests mit Standardsubstanzen, deren toxisches Potential weitgehend bekannt ist, und Organo-Metallkomplexen (ein Rhodium-Komplex und drei verschiedene Iridium-Komplexe) wurden erste Proliferationshemmungsmuster und Promotor-Induktionsmuster erstellt. Diese wurden genutzt, um das toxische Potential dieser bislang nicht weiter charakterisierten Substanzen im Vergleich mit den bekannten Referenzsubstanzen abzuschätzen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß Kombinationen von Reportergenkonstrukten genutzt werden können, um mit vergleichsweise einfachen Experimenten Muster der zellulären Wirkungen von Substanzen zu erhalten, die eine (erste)Abschätzung toxischer Wirkungen von Substanzen ermöglichen

Minicircles as multifunctional tools for the enhancement of transient gene expression in mammalian cell lines

Die transiente Genexpression (TGE) ist eine industriell an Bedeutung zunehmende Methode, Proteine in kürzester Zeit in Säugerzellen zu produzieren. Ihr umfangreicher Einsatz ist jedoch durch eine zumeist rapide Abnahme der Transgenexpression eingeschränkt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein transienter Ansatz unter Verwendung von Scaffold / Matrix Attachment Regions (S/MARs) und minimalen, nicht-viralen Vektorsystemen (Minicircles) im Vergleich zu pEpi-basierten Parentalplasmiden in HEK293-Zellen getestet. Die verwendeten S/MAR-Elemente waren die etablierte M18-S/MAR (Broll et al., 2010) und eine neuartige Sequenz („CMV-S/MAR“; Wirth, M., unpublished), die im Rahmen dieser Arbeit eindeutig als S/MAR identifiziert werden konnte. Die TGE wurde darüber hinaus unter Verwendung kommerziell erhältlicher Plasmide analysiert. Für beide S/MAR-Elemente (M18 und CMV) wurde eine spezifische, transiente Expressionssteigerung in Minicircles gegenüber den entsprechenden Parentalplasmiden nachgewiesen (S/MAR-Minicircle- bzw. SMC-Effekt), wobei die Wirkung der beiden S/MARs unterschiedlich war. Darüber hinaus führte das Einführen zweier CMV-S/MAR-Elemente in pCMV-GLuc-Konstrukten zu einer relativen Steigerung der TGE um etwa dreihundert Prozent. Die in dieser Arbeit ermittelte transiente Aktivität von S/MAR-Elementen ist neu und unerwartet, eröffnet jedoch erweiterte (industrielle) Anwendungsmöglichkeiten für S/MAR-basierte Minicircles. Um den erhöhten DNA-Bedarf für die TGE auch bei der Verwendung von Minicircles decken zu können, wurde in dieser Arbeit der Flpe-basierte, sog. pAIO-Vektortyp entwickelt und das Produktionsprotokoll optimiert. Dies führte zu einer mindestens zehnfachen Steigerung der Minicircle-Ausbeute im Vergleich zu konventionellen Flp-basierten Methoden. Die auf diese Weise hergestellten Minicircles können durch minimale Veränderungen mit Flp-RMCE-Techniken kombiniert werden, was sie für die industrielle Anwendung interessant macht.Transient gene expression (TGE) is a method with increasing industrial acceptation to produce proteins in a very short period of time in mammalian cells. Wide application, however, is limited by a rapid decrease of transgene expression. In the present work a transient approach of using scaffold / matrix attachment regions (S/MARs) and minimal, nonviral vector systems (minicircles) was tested in HEK293 cells and compared to pEpi-based parental plasmids. The S/MAR elements used here were the established M18-S/MAR (Broll et al., 2010) and a new sequence (‚CMV-S/MAR’; Wirth, M., unpublished), which could be clearly identified as an S/MAR in the course of the studies. In addition, TGE was analysed by using commercially available plasmids. With the use of both S/MAR elements (M18 and CMV) a specific increase of transient gene expression was shown in minicircles, compared to corresponding parental plasmids (S/MAR-minicircle- or SMC-effect), but both S/MARs revealed different properties. Furthermore, two CMV-S/MAR elements lead to a relative 300-percent increase of TGE in pCMV-GLuc-constructs. The transient activity of S/MAR elements, which could be identified in the present work, is new and unexpected. However, it opens advanced (industrial) application for S/MAR-based minicircles. To further meet the needs of increased minicircle DNA amounts for TGE a novel, Flpe-based, so-called pAIO vector type was developed in this work. The protocol for minicircle production was also optimized. This lead to an increase of minicircle yield of at least a factor ten, compared to conventional Flp-based methods. Minicircles that are produced in this way can be easily combined with Flp-RMCE techniques since they are based on the Flp recombinase system. Therefore they are potentially interesting for industrial application

Signaltransduktion durch Zwei-Komponenten Systeme in dem halophilen Archaeon Halobacterium salinarum

Die vorliegende Arbeit diente der funktionellen Charakterisierung der Zwei-Komponenten Systeme (ZKS) des halophilen Archaeons Halobacterium salinarum. Von der Existenz mehrerer Histidinkinasen (HK) und Antwortregulatoren (RR) neben dem Chemotaxis-ZKS CheA/CheY weiss man nur aufgrund der Sequenzierung des Genoms. Folglich fehlten bislang funktionelle Beschreibungen dieser Proteine. Die vorgelegte Dissertation begann, diesen Mangel zu beheben. Den Laborversuchen war eine bioinformatische Bestandsaufnahme vorgeschaltet, welche die Sensordomänen der HK, die Effektordomänen der RR und die konservierten ZKS-Domänen beider Proteinklassen nach greifbaren Anhaltspunkten durchforstete. Diese Rasterfahndung vermochte jedoch nur bescheidene Hinweise auf die Funktionen und Wechselwirkungen der HK und RR zu erbringen. Die praktischen Arbeiten zur funktionellen Charakterisierung der halobakteriellen ZKS basierten auf zwei unterschiedlichen Strategien. Der erste Ansatz bestand in dem Versuch einer Funktionszuordnung über die Applikation eines Phosphatmangels, dem alle bislang daraufhin untersuchten Prokaryoten durch eine exklusiv ZKS gesteuerte, differentielle Genexpression entgegenwirken. Im zweiten Ansatz wurde mit OE3855R eine der wenigen HK, deren Primärsequenz einen Hinweis auf die Proteinfunktion lieferte, eingehend biochemisch analysiert. Für die Phosphatmangelversuche musste zunächst geprüft werden, bei welchem Nährstoffangebot H. salinarum in eine Unterversorgung gerät. Den Experimenten zufolge limitiert ein Phosphatgehalt von weniger als 0,5mM im Medium die finale Wachstumsdichte. Die mangelhafte Phosphatversorgung induziert das Gen aph, was zu einer verstärkten Produktion und Sekretion des Enzyms Alkalische Phosphatase führt. Mikroarray-Analysen und RT-qPCR-Experimente deckten auf, dass das halobakterielle Pho-Regulon mehrere ABC-Transportsysteme und verschiedene sekretierte Enzyme umfasst. Über die somit stark verbesserten Phosphataufnahmefähigkeiten hinaus ändert sich die Transkription einer Vielzahl weiterer Gene, wobei es sich wahrscheinlich um sekundäre Effekte handelt. Während der Hungerphase verbraucht H. salinarum drei Viertel seines intrazellulären Phosphatspeichers. Die massive Abnahme des Phosphatvorrats ist nicht nur die Folge der Mangelversorgung, sondern gleichzeitig verantwortlich für die Induktion des Pho-Regulons. Das zuständige Regulatorprotein wurde bislang nicht enttarnt. Durch Konstruktion mehrerer Deletionsstämme konnten klassische ZKS als Signaltransduktoren überraschenderweise ausgeschlossen werden. Die Induktion von Proteinen mit Homologien zu DNA bindenden Bereichen von Transkriptionsfaktoren und zu dem regulatorischen Mediatorprotein PhoU deutet auf einen alternativen Regelkreis hin. Dieser wäre exklusiv für Archaea, da solche PhoU-Chimären ausschließlich in archaealen Genomen zu finden sind. Von der Anpassung des Proteininventars abgesehen orientieren H. salinarum-Zellen ihre Bewegungen an einem Phosphatgradienten. Diese Chemotaxis wird durch Phosphatmangel induziert und durch das Zwei-Komponenten System CheA-CheY vermittelt. Erstmals in einem Archaeon gezeigt, wird die Phosphattaxis von H. salinarum ausschließlich von anorganischem Phosphat ausgelöst. Laut Primärsequenzanalyse besitzt die Histidinkinase OE3855R eine Häm bindende PAS-Domäne (PAS3855) und könnte daher einen Sauerstoffsensor darstellen. Eine heterologe Expression von PAS3855 sollte dieser Hypothese Substanz verleihen. Das exprimierte Polypeptid enthielt geringe Mengen eines Kofaktors, der mittels Absorptionsspektroskopie und LC-MS-Analyse als Häm des Typs B identifiziert wurde. Auf Basis dieses Wissens erfolgte die Rekonstitution der Domäne mit HämB, was die Bildung eines Tetramers induzierte. Die spektroskopische Analyse entlarvte große Ähnlichkeiten zwischen den elektronischen Zuständen der zentralen Häm-Eisenionen von PAS3855 und dem Häm bindenden Redoxsensorprotein Dos aus E. coli. Da die Reduktion von FeIII- zu FeII-PAS3855 die Oligomerisierung der Domäne von einem Tetramer zu einem Dimer veränderte, lag eine redoxabhängige Signalfunktion der Histidinkinase OE3855R nahe. Die Deletion des kodierenden Gens führte zu keinem erkennbaren Phänotyp, weshalb zum gegenwärtigen Zeitpunkt keine Aussage getroffen werden kann, ob diese HK in vivo tatsächlich als Redox- oder auch Sauerstoffsensor fungiert

The Quantum Strategy of Completeness: On the Self-Foundation of Mathematics

Gentzen’s approach by transfinite induction and that of intuitionist Heyting arithmetic to completeness and the self-foundation of mathematics are compared and opposed to the Gödel incompleteness results as to Peano arithmetic. Quantum mechanics involves infinity by Hilbert space, but it is finitist as any experimental science. The absence of hidden variables in it interpretable as its completeness should resurrect Hilbert’s finitism at the cost of relevant modification of the latter already hinted by intuitionism and Gentzen’s approaches for completeness. This paper investigates both conditions and philosophical background necessary for that modification. The main conclusion is that the concept of infinity as underlying contemporary mathematics cannot be reduced to a single Peano arithmetic, but to at least two ones independent of each other. Intuitionism, quantum mechanics, and Gentzen’s approaches to completeness an even Hilbert’s finitism can be unified from that viewpoint. Mathematics may found itself by a way of finitism complemented by choice. The concept of information as the quantity of choices underlies that viewpoint. Quantum mechanics interpretable in terms of information and quantum information is inseparable from mathematics and its foundation

Expressionsprofile von ABC-Transportern in Arabidopsis thaliana

Die Superfamilie der ABC-Proteine ist eine der größten bisher bekannten Proteinfamilien. Ihre Mitglieder enthalten ein oder zwei nukleotidbindende Domänen mit je einem Walker A- und B-Motiv, sowie das charakteristische ABC-Motiv. Ein Großteil darunter sind Membranproteine, die zusätzlich ein oder zwei Transmembrandomänen besitzen. Diese ABC-Transporter sind vor allem in Mensch und Hefe charakterisiert, wo sie in zahlreichen Transportprozessen über die Membranen involviert sind. Über die Funktion der ABC-Transporter in pflanzlichen Organismen ist wenig bekannt, jedoch gibt es Hinweise dass diese Proteinfamilie in Pflanzen auch an der Kompartimentierung von Fremdstoffmetaboliten beteiligt ist. In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana wurden 103 ABC-Transportergene annotiert, die sich in 9 Subfamilien aufteilen. Experimentell nachgewiesen wurden bisher lediglich 6 Mitglieder aus 2 Subfamilien. In dieser Arbeit wurden 28 ABC-Transporter aus 6 Subfamilien, davon 4 bisher nicht untersuchte, hinsichtlich organspezifischer Expression und Induktionsverhalten nach Herbizid- bzw. Safenerbehandlung untersucht. Dazu wurde ein DNA-Array ("Detox-Array") mit genspezifischen Sonden zur parallelen Transkriptanalyse etabliert. Zusätzlich wurden in Zusammenarbeit mit anderen Projekten weitere Genfamilien mit einbezogen, die potenziell an der Detoxifizierung von Xenobiotika beteiligt sind (Cytochrom P450 Monooxygenasen, Glutathion-S-Transferasen und UDP-Glycosyltransferasen), um Koregulationen einzelner Mitglieder der unterschiedlichen Genfamilien untersuchen zu können. Um die Unterscheidung auch hoch homologer Mitglieder dieser Familien zu ermöglichen, wurden Sonden aus dem 3‘-untranslatierten Bereich dieser Gene entwickelt und auf ihre Eignung zur Transkriptmessung untersucht. Die Expressionsanalyse der ABC-Transporter in Wurzeln, Stängeln, Blättern, Blütenständen und Schoten zeigte neben den sechs bereits bekannten ABC-Transportern Transkripte von 21 weiteren Vertretern. Die meisten waren in der Wurzel (26 von 28) nachzuweisen, die wenigsten (7 von 28) im Blatt. Am höchsten exprimiert waren AtMRP12 und AtPDR8 in der Wurzel und AtMRP5 in der Schote. Die Induktion der ABC-Transporter durch Xenobiotika wurde an Pflanzen 24h oder 36h nach Behandlung mit unterschiedlichen Chemikalien (Primisulfuron, Bromoxynil, Benoxacor) in sublethalen Dosen untersucht. Für die beiden Herbizide typische Schäden konnten erst 3 Tage nach der Behandlung beobachtet werden. Neben der in der Literatur beschriebenen Primisulfuron-Induktion von AtMRP3 (Tommasini et al., 1997) waren AtPDR8, AtMRP5, AtMRP4 und AtAOH1 transient nach 24h induziert. Mit einem Antiserum, das gegen die Subfamilie der PDR-Transporter erzeugt worden war, konnte deren Induktion durch Primisulfuron und Benoxacor auch auf Proteinebene nachgewiesen werden. Eine spezifische 6-fache Induktion nach Bromoxynil-Behandlung zeigte der ABC-Transporter AtTAP1. Die sechs genannten ABC-Transporter stellen somit Kandidaten dar, die an der Kompartimentierung von Metaboliten beteiligt sein können. Dabei kann es sich entweder um Primisulfuron- bzw. Bromoxynilmetabolite oder durch die Behandlung mit den Xenobiotika entstandene endogene Metabolite handeln. Eine Hauptkomponentenanalyse der Expressionsprofile zeigte, dass auf der Basis der auf dem Detox-Array vertretenen, aus dem Entgiftungs- und Sekundärmetabolismus ausgewählten Genfamilien eine eindeutige Unterscheidung der Antwort auf die verschiedenen Herbizide abgeleitet werden kann. Weitere Daten aus Kollaborationen mit anderen Projekten wurden in einer zweiten Hauptkomponentenanalyse mit einbezogen und zeigen, dass die Unterschiede vor allem auf die sekundären Auswirkungen der Herbizide zurückzuführen sind. Die dabei gefundene Koregulation der Primisulfuron-Behandlung mit der Reaktion auf das Signalmolekül Salicylsäure und ein bakterielles Pathogen ließ weiter schließen, dass Primisulfuron einen Elicitor-ähnlichen Effekt auf die Pflanze hat. Zur weiterführenden Funktionsanalyse von ABC-Transportern wurden parallel zu diesen Arbeiten knock-out Mutanten gesucht. In einer Kollektion des MPI für Züchtungsforschung in Köln konnten zwei Mutanten identifiziert werden, die jeweils ein En-Transposon innerhalb der offenen Leserahmen von AtPDR4 bzw. AtMDR4 besitzen

A Mathematical Model of Quantum Computer by Both Arithmetic and Set Theory

A practical viewpoint links reality, representation, and language to calculation by the concept of Turing (1936) machine being the mathematical model of our computers. After the Gödel incompleteness theorems (1931) or the insolvability of the so-called halting problem (Turing 1936; Church 1936) as to a classical machine of Turing, one of the simplest hypotheses is completeness to be suggested for two ones. That is consistent with the provability of completeness by means of two independent Peano arithmetics discussed in Section I. Many modifications of Turing machines cum quantum ones are researched in Section II for the Halting problem and completeness, and the model of two independent Turing machines seems to generalize them. Then, that pair can be postulated as the formal definition of reality therefore being complete unlike any of them standalone, remaining incomplete without its complementary counterpart. Representation is formal defined as a one-to-one mapping between the two Turing machines, and the set of all those mappings can be considered as “language” therefore including metaphors as mappings different than representation. Section III investigates that formal relation of “reality”, “representation”, and “language” modeled by (at least two) Turing machines. The independence of (two) Turing machines is interpreted by means of game theory and especially of the Nash equilibrium in Section IV. Choice and information as the quantity of choices are involved. That approach seems to be equivalent to that based on set theory and the concept of actual infinity in mathematics and allowing of practical implementations