Synthese modularer chemischer Schalter für die optische Mikro- und Nanoskopie

Die Fluoreszenzmikroskopie ist ein elementares Werkzeug zur Untersuchung molekularer Vorgange auf der Nanometerskala, das sich in den Lebenswissenschaften breit etabliert hat. Durch spektrale Separation können mehrere mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Proteine verfolgt und ihre Interaktionen untereinander sogar in lebenden Zellen aufgeklärt werden. Limitiert wird dies jedoch durch Beugungseffekte, die die Auflösung optischer Abbildungen auf etwa 200nm begrenzt, sowie durch chromatische Aberrationen, welche eine Korrelation verschiedener Strukturen bei Verwendung mehrerer Farbkanäle erschwert. Mit Hilfe molekularer Fluoreszenzschalter können beide Limitationen zugleich überwunden werden: durch chemisch induziertes Einzelmolekülblinken für die Lokalisationsmikroskopie (Chiron - Chemically Improved Resolution for Optical Nanoscopy) und chemisches Multiplexing (ChemPlexing) zur monochromatischen Abbildung mehrerer Strukturen. Als Vorarbeit wurden modulare chemische Schalter entwickelt, die basierend auf einem DNA-Doppelstrang einen Liganden in räumliche Nahe eines Farbstoffs bringen und durch Cu2+-Koordination reversibel in ihrer Emission geschaltet werden können. Die Fluoreszenzlöschung erfolgt dabei durch einen photoinduzierten Elektronentransfer. Durch Variation von Ligand und Farbstoff wurden neue Verbindungen mit höherer Affinität, geringerer Restfluoreszenz im gelöschten Zustand und einer höheren Photostabilität erhalten. In Lokalisationsexperimenten konnte das chemisch induzierte Blinken einzelner Moleküle ausgenutzt werden, um eine Auflösung von rund 90nm zu erreichen. Zudem wurde das chemische Multiplexing als Methode zur Abbildung mehrerer Strukturen in einem Farbkanal etabliert. Durch Kombination herkömmlicher Immunfluoreszenz mit chemischen Schaltern konnten so bis zu vier Strukturen in einer Probe in zwei spektralen Kanälen sequentiell abgebildet werden. Des Weiteren wurden die Grenzen der Methode ausgetestet und auch ihre Anwendbarkeit in der hochauflösenden STED-Mikroskopie demonstriert. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden darüber hinaus neue, auf den Aminosäuren Lysin und 3-Amino-Alanin basierende chemische Schalter mit Dipicolylamin als Ligand entwickelt. Um diese für eine breite Nutzung zugänglich zu machen wurden verschiedene Funktionalitäten (Propargyl-Gruppe, Biotin, (Methyl)-Tetrazin, Halogenalkan, Benzylguanin) verwendet. Am überzeugendsten zeigte sich dabei die Kombination aus Propyl-Atto565 und Biotin-Linker an Dipicolyl-Alanin mit einer Komplexbildungskonstante für Cu2+ von (3.03 +- 0.61) 10^7 L/mol und eine sehr niedrige Restfluoreszenz des gelöschten Zustands von (0.9 +- 0.1) %. In Lokalisationsexperimenten an markierten Mikrotubuli in NIH 3T3 Zellen konnte eine Auflösung von (89 +- 14) nm erreicht werden. Auch beim chemische Multiplexing, sowohl im konfokalen als auch im STED-Mikroskop, konnte eine Auflösung von etwa 90nm in beiden Kanälen demonstriert werden. Das eingeführte Halogenalkan-Derivat als Substrat für das enzymatische Halo-Tag lieferte ebenso gute Ergebnisse wie die Derivate mit Tetrazin- und Methyl-Tetrazin-Funktionalität zur Markierung mittels Kupfer-freier Click-Reaktion. Damit eröffnen sich für die chemischen Schalter vielfältige Methoden zur Markierung, die nun theoretisch auch in lebenden genetisch veränderten Zellen durchführbar sind