Transcriptional analysis to identify the iron uptake systems of Mannheimia haemolytica

Mannheimia haemolytica und Pasteurella multocida gehören zu den Verursachern der unter Rindern weltweit verbreiteten Enzootischen Bronchopneumonie. Derzeitige Impfstoffe und Antibiotika gegen diese Bakterien können die Verbreitung der Krankheit nicht maßgeblich einschränken, weshalb Bedarf an neuen Medikamenten besteht. Bei der Besiedelung der Lunge treffen M. haemolytica und P. multocida auf Eisenmangel. Die Aufnahme von Eisen ist ein wesentlicher Faktor bei der Kolonisierung und Persistenz pathogener Bakterien im Wirt, da Eisen essentiell ist. Medikamente, die an Proteinen der Eisenversorgung angreifen, können deshalb zur Eindämmung der Bronchopneumonie beitragen. Um einen Überblick über die Gene von M. haemolytica und P. multocida zu erhalten, die bei der Adaptation an Eisenmangel beteiligt sind, wurden die Bakterien in der vorliegenden Arbeit in vitro unter Eisenmangel kultiviert, denn die meisten bakteriellen Gene, die an der Eisenaufnahme beteiligt sind, werden erst bei Eisenmangel transkribiert. Mittels Mikroarray-Analyse der Transkriptome wurden erstmals die in vitro eisenregulierten Gene von M. haemolytica und erstmals auch die eisenregulierten Gene eines Rinder-Isolats von P. multocida identifiziert. Der in dieser Arbeit verwendete Mikroarray war ein Multigenom-Mikroarray und stellt die offenen Leserahmen beider Bakterien dar. Mit der Mikroarray-Analyse wurden 129 Gene von M. haemolytica identifiziert, die bei Wachstum unter Eisenmangel eine veränderte Transkription aufwiesen. Die größte Gruppe der Gene mit verstärkter Transkription bildeten die Gene, die für Rezeptoren und Transporter kodieren. Von diesen kodieren etwa drei Viertel für Proteine, die an der Aufnahme von Eisen aus verschiedenen Quellen beteiligt sind. Die größte Gruppe der Gene mit verminderter Transkription wurde von Genen gebildet, die für Proteine des Energie-Stoffwechsels kodieren. Damit wurde auch für M. haemolytica das Prinzip bestätigt, dass Bakterien bei Eisenmangel verstärkt Gene transkribieren, deren Proteine an der Eisenaufnahme beteiligt sind, während Gene für eisenhaltige Proteine des Energie-Stoffwechsels vermindert transkribiert werden. Bei der Analyse des Transkriptoms von P. multocida wurden 173 Gene mit veränderter Transkription identifiziert. Auch bei P. multocida konnte mit der funktionellen Klassifizierung der kodierten Proteine die größte Gruppe an Genen mit verstärkter Transkription den Transport- und Bindungsproteinen zugeordnet werden. Die größte Gruppe an Genen mit verminderter Transkription wurde auch bei P. multocida von Genen gebildet, die für Proteine des Energie-Stoffwechsels kodieren. Beim Vergleich des Transkriptoms von M. haemolytica mit dem von P. multocida wurden mehr Unterschiede als Gemeinsamkeiten festgestellt. Nur 40 der 1424 homologen Gene zeigten die gleiche Richtung in der Änderung in der Transkription. Unter den 15 homologen Genen mit verstärkter Transkription waren die Gene, die für einen Hämoglobin-Rezeptor, die ABC-Transportsysteme FbpABC und YfeABCD sowie das Energie liefernde System TonB-ExbBD kodieren. In den 25 homologen Genen mit verminderter Transkription waren 15 Gene enthalten, deren kodierte Proteine am Energie-Stoffwechsel beteiligt sind. Dies waren die Proteine NapABCDFGH des Nitrat-Reduktase-Komplexes, die Proteine NrfABCD des Nitrit-Reduktase-Komplexes und die Proteine FrdABCD des Komplexes der Fumarat-Reduktase. Ein auffälliger Unterscheid war, dass bei M. haemolytica die gesamten Gene verstärkt transkribiert wurden, deren Proteine an der Aufnahme von Eisen aus Transferrin beteiligt sind. Bei P. multocida dagegen konnte das Gen für den Transferrin-Rezeptor nicht nachgewiesen werden. Somit gehört das in dieser Arbeit verwendete Isolat von P. multocida vermutlich zu den 30% der Rinder-Isolate von P. multocida, die keinen Transferrin-Rezeptor besitzen, aber die Rinderlunge besiedeln können (Ewers et al., 2006). Im Vergleich zu M. haemolytica fielen bei P. multocida die vielen verstärkt transkribierten Gene auf, die an der Aufnahme von Eisen aus dem Blut beteiligt sind. Die Transkription dieser verschiedenen Transporter deutet auf eine gute Adaptation von P. multocida für die Verwendung von Eisen aus dem Blut des Wirts hin, die bei M. haemolytica in diesem Maß nicht gegeben scheint. Für M. haemolytica wurde die in vivo-Relevanz einiger eisenregulierter Gene überprüft, die in der Mikroarray-Analyse eine erhöhte Transkription zeigten. Dazu wurde die RNA untersucht, die aus dem Lungengewebe von infizierten Rindern isoliert worden war. In diesem Gewebe wurde die Transkription von 11 Genen mittels RT-PCR nachgewiesen. Für die Gene, die für die Hämoglobin-Rezeptoren von M. haemolytica kodieren, wurde mittels quantitativer real time PCR auch eine Verstärkung der Transkription im Lungengewebe nachgewiesen. Die Verstärkung der Transkription in vivo war der transkriptionellen Verstärkung in vitro vergleichbar, was auf eine Funktion der Hämoglobin-Rezeptoren bei der Infektion in vivo hindeutet. Zur Untersuchung der Regulation des Eisenhaushalts von M. haemolytica wurde versucht, das Gen fur zu deletieren, das für den Hauptregulator des Eisenhaushalts kodiert, was jedoch nicht gelungen ist. In einem antisense-Ansatz konnte jedoch gezeigt werden, dass der Stamm mit dem fur-antisense-Plasmid ein signifikant verzögertes Wachstum hatte, was auf die essentielle Funktion des Gens fur in M. haemolytica hinweist. Ein antisense-Ansatz ist noch kein Beweis für die essentielle Funktion eines Gens. Doch die mit Gioia et al. (2007) übereinstimmenden Schwierigkeiten bei der Herstellung einer ∆-fur-Mutante von M. haemolytica sowie das verringerte Wachstum in Gegenwart der fur-antisense-mRNA deuten stark auf eine essentielle Funktion dieses Gens hin.Mannheimia haemolytica and Pasteurella multocida belong to the causative agents of bovine respiratory disease complex. This severe pneumonia is the most important respiratory disease in cattle and causes enormous financial losses in the cattle industry. As the vaccines and antibiotics to treat bovine pneumonia are not very efficient in reducing the prevalence of the disease, new pharmaceuticals are needed. A prerequisite of successfully colonising the host is the ability of pathogenic bacteria to adapt to the paucity of iron. Because of the necessity to acquire host-derived iron, pharmaceuticals that intervene in the uptake of iron or its regulation could help reducing pneumonic pasteurellosis. In order to understand how M. haemolytica and P. multocida adapt to the paucity of iron microarray technology was used to analyse the response to iron deficiency in a genome wide manner for both pathogens. Growth under iron limitation was chosen since most bacterial genes involved in iron uptake are only transcribed under iron limitation. In this work the in vitro iron regulated genes from M. haemolytica were identified for the first time and also the iron regulated genes of a bovine isolate of P. multocida. The transcriptional profile of a bovine isolate of P. multocida was produced to compare two closely related bacteria that colonize the same habitat, the bovine lung. The microarray was a multi-genome microarray and contains the open reading frames of both M. haemolytica and P. multocida. The microarray analysis of M. haemolytica grown under iron limitation revealed a total of 129 genes with altered transcription. The largest group of genes with induced transcription contained genes encoding several receptors and transporters. Three quarters of them code for proteins involved in iron uptake from different sources. The largest group of genes with reduced transcription was build by genes encoding iron containing proteins involved in energy metabolism. This result shows that under iron limitation M. haemolytica intensifies the transcription of genes encoding proteins for iron uptake, while the transcription of genes coding for iron containing proteins involved in energy metabolism is repressed. This strategy is also observed in other bacteria. Analysis of the transcriptome of the bovine isolate of P. multocida grown under iron limitation revealed 173 genes with altered transcription. The functional classification revealed that the largest group of genes with intensified transcription belonged to a group of genes coding for proteins involved in transport and binding. Two thirds of these encode proteins with functions in iron uptake. The largest group of genes with down regulated transcription was also found to be involved in energy metabolism. Comparing the transcriptomes of M. haemolytica and P. multocida more different than common strategies were shown. Only 40 of 1424 homologous genes had the same direction of transcriptional change. Homologous genes with increased transcription (15) coded for a haemoglobin receptor of the outer membrane, the ABC-transport systems FbpABC and YfeABCD and the genes coding for the TonB-ExbBD energy transmitting system. Homologous genes with decreased transcription (25) coded for iron containing proteins mostly involved in energy metabolism under anaerobic conditions. They included the genes coding for the nitrate reductase complex NapABCDFGH, the nitrite reductase complex NrfABCD, and the fumarate reductase complex FrdABCD. An obvious difference between the two bacteria was that in M. haemolytica genes coding for the entire transport chain of iron derived from transferrin were induced under iron limitation. In contrast, the genes encoding the transferrin receptor were not detected in the genome of the bovine isolate of P. multocida. This bovine isolate of P. multocida seems to belong to the 30 % of bovine isolates that possess no transferrin receptor but nevertheless colonise the bovine lung (Ewers et al., 2006). A second obvious finding was that in P. multocida the induced transcription of several genes encoding proteins for the uptake of iron from serum sources like haem, haemoglobin and haemoglobin-haptoglobin. M. haemolytica on the other hand has fewer genes coding for proteins involved in the utilisation of iron from haem or haemoglobin. Possibly, the many possibilities to use haem as an iron source in P. multocida compensates for the deficiency in using transferrin as an iron source. For some genes of M. haemolytica with induced transcription in vitro the in vivo transcription was tested. Transcription of 11 genes induced under in vitro iron depletion was detected using RT-PCR in the RNA derived from M. haemolytica-infected lung tissue. For the two haemoglobin receptors HmbR1 and HmbR2 a transcriptional increase as compared to the hmbR1 and hmbR2 mRNA levels in the inoculum was detected by quantitative real time PCR. The level of induction was comparable to the transcriptional change under iron paucity in vitro demonstrating that the iron depleted in vitro culture conditions mimicked the situation in the bovine lung. In order to examine the regulation of iron uptake in M. haemolytica several attempts were made to produce a mutant lacking the fur gene encoding the main regulator for iron uptake. The attempts were not successful, indicating that fur may be essential in M. haemolytica. A putative function of fur for M. haemolytica viability was demonstrated by an antisense approach. M. haemolytica carrying a fur-antisense-plasmid transcribing fur in antisense direction grew significantly slower than the control. This hints at an essential necessity of the gene fur in M. haemolytica. Further evidence for this notion was produced by Gioia et al. (2007), who were also unsuccessful in producing a ∆-fur-mutant in M. haemolytica

Gesprächstranskription auf dem Computer - das System EXMARaLDA

Der Einsatz des Computers zur Transkription natürlicher Gespräche ist in der Praxis zwar weit verbreitet, die schnelle Weiterentwicklung der Computertechnologie hat aber dazu geführt, dass verschiedene Systeme oft scheinbar zusammenhangslos nebeneinander stehen, ohne dass ihre Gemeinsamkeiten und Unterschiede Gegenstand einer umfassenden theoretischen Betrachtung wären. Der vorliegende Aufsatz will einen Beitrag zu einer solchen theoretischen Betrachtung der Gesprächstranskription auf dem Computer liefern, indem er einerseits einige grundlegende Überlegungen zu diesem Thema anstellt, andererseits einige allgemeine Aspekte der Konzeption und Umsetzung des Systems EXMARaLDA, das am SFB "Mehrsprachigkeit" an der Universität Harnburg entwickelt wird, beschreibt.Although the use of a computer for the transcription of natural conversation is wide-spread in practice, we observe that - due to the rapid development in computer technology -different systems often stand side-by-side in an apparently unrelated manner without their commonalities and differences being subject to theoretical considerations. The presents paper intends to make a contribution to such a theoretical view of computer transcription of conversation: on the one hand, it contains some basic reflections on the subject, and on the other hand it describes some general aspects of the concept and realisation of the system EXMARaLDA which is being developed at the SFB "Mehrsprachigkeit" at the University of Hamburg

Abduktion und Transkription : Perspektiven der Editionsphilologie im Spannungsfeld von Konjektur und Krux

Geht man davon aus, die Aufgabe der Philologie sei eine – wie auch immer geartete – »historische Textpflege«, die auf die »Ermittlung und Wiederherstellung von Texten« abzielt, dann steht die Aufgabe der Wiederherstellung in einem Spannungsverhältnis zwischen dem Lesbarmachen und der Bewahrung eines Texts: In welchem Maße darf man in einen überlieferten Text eingreifen, um ihn lesbar zu machen? In welchem Maße muss man einen Text in seiner überlieferten Form bewahren? Die Formulierung ›in welchem Maße‹ macht deutlich, dass es sich um eine Frage der Angemessenheit handelt, deren Antwort zum einen davon abhängt, mit welchen Schwierigkeiten sich die Aufgabe der Wiederherstellung des Textes konfrontiert sieht, zum anderen von der gerade vorherrschenden ›Methodenpolitik‹, die gleichsam als »stilgemäßer Denkzwang« fungiert. Konjektur und Krux markieren dabei – so haben wir einleitend erklärt – zwei komplementäre Positionen, zwischen denen die Methodenpolitiken der Editionsphilologie changieren. Die Konjektur, gefasst als »plausible Vermutungen zur Verbesserung des Textes«, ist eine inferentielle Intervention, um einen lücken- oder fehlerhaften Text wieder herzustellen mit dem Ziel, ihn lesbar und verstehbar zu machen. Die Krux, gefasst als indizierte Nicht-Intervention, bewahrt den Text in seiner Unvollständigkeit und Fehlerhaftigkeit – auch auf die Gefahr hin, dass Lesbarkeit und Verstehbarkeit darunter leiden

Sprachliche Variabilität des Deutschen und ihre Erfassung mit Methoden der automatischen Spracherkennung

Die Datenbank wird auf den Ergebnissen der Analyse einschlägiger umfangreicher Korpora des gesprochenen Deutsch basieren. Um jedoch große Korpora analysieren zu können, ist es notwendig, automatische Analyseverfahren der Variation zu entwickeln. Mit traditionellen manuellen Methoden kann der Aufbau einer korpusbasierten Datenbank kaum verwirklicht werden. Dem eigentlichen Variationsprojekt wurde daher eine kleine Pilotstudie vorgeschaltet, die die Möglichkeiten der automatischen Analyse prüfen sollte. Dabei wurde der Frage nachgegangen, ob es möglich ist, regionale Varianten des Deutschen mit Verfahren der automatischen Spracherkennung zu untersuchen, d.h., ob es möglich ist, eine verlässliche Transkription der regionalen Varianten automatisch herzustellen. Diese Pilotstudie zur automatischen Transkription stützte sich auf das im IDS bereits vorhandene System SPRAT (Speech Recognition and Alignment Tool), das zum Alignieren (Text-Ton-Synchronisation) verwendet wird. Im Rahmen der Pilotstudie wurde dieses System modifiziert und in einer Reihe von Tests dessen automatische Transkription evaluiert (vgl. Abschnitt 3). Das Ziel des vorliegenden Beitrags ist es, die Ergebnisse dieser Pilotstudie vorzustellen. Zunächst aber soll ein kurzer Exkurs verdeutlichen, um welches System es sich beim IDS-Aligner SPRAT handelt

Der Einsatz von Sprachtechnologie in Oral-History-Sammlungen

This book chapter presents an overview of the techniques from the field of automatic speech recognition that can contribute to the enhanced accessibility of online oral history interview collections

Angaben zur deutschen Standardaussprache im entstehenden "Großen deutsch-tschechischen akademischen Wörterbuch" (GDTAW) als Kunst des Möglichen

The present article considers how and to which extent the correct German pronunciation is to be entered into the "German-Czech Academic Dictionary" (LGCAD) being written. The authors state that the codified pronunciation of the German Standard ("deutschländisches Deutsch") is the most suitable pronunciation norm because it represents most German speakers despite its many existing variations. This norm, represented by DUDEN, vol. 6 ("Das Aussprachewörterbuch"), is commented with special regard to the role of the German standard in foreign language teaching in the Czech Republic. The authors claim that the teachers ("model speakers" according to Ulrich Ammon’s model of four social forces) as well as dictionary users have to follow a single codified pronunciation norm. For practical reasons, regional varieties shall be selected only according to the "Duden Universalwörterbuch" and "Variantenwörterbuch". In addition, dictionary authors have to focus on the most striking interferences between German and Czech as researched and described by Marie Maroušková