Transformación Genética Mediada por Agrobacterium Tumefaciens en Frijol Común (phaseolus vulgaris L.).

62 hojasEl frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es la leguminosa más importante para el consumo directo humano. Es considerado la principal fuente de proteína para millones de personas a nivel mundial, principalmente en los países en vía de desarrollo. Dentro del contexto de mejoramiento genético con tecnologías no convencionales como la biotecnología, P. vulgaris se ha caracterizado por ser recalcitrante tanto al proceso de regeneración in vitro como a la transformación genética. el propósito de este trabajo fue desarrollar un protocolo de transformación genética mediado por A. tumefaciens basado en los protocolos existentes para soya (Glycine max L.). La transformación se llevó a cabo a partir de explantes del nudo cotiledonar, con la cepa de A. tumefaciens EHA105 en tres variedades de frijol de interés comercial (Chauchachuga, ICA Quimbaya y Calima). Se realizaron pruebas de expresión transitoria del gen GUS, las cuales dieron positivas en las tres variedades.10.2 PREPARACIÓN DEL INÓCULO DE AGROBACTERIUM ....... 26 10.3 INOCULACIÓN Y COCULTIVO ............................. 27 10.4 INDUCCIÓN DE BROTES .................. 28 10.5 ENRAIZAMIENTO ........................ 28 10.6 ELONGACIÓN Y ESTABLECIMIENTO DE PLANTAS EN SUELO ......... 29 10.7 ENSAYO DE MORTALIDAD DE EXPLANTES POR HIGROMICINA .... 29 10.8 ENSAYO DE EXPRESIÓN TRANSITORIA DEL GEN GUS ...... 30 10.9 PRUEBAS DE DETECCIÓN DEL T-DNA POR PCR ..... 31Tesis (Biologia) Universidad de los Llanos. Resultado para Obtener el Título de Biólogo. El Trabajo Impreso se Encuentra Ubicado en la Colección de Hemeroteca Identificado con el Número BIO 0040.PregradoBiologí

Factores que influyen en la transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens en Phaseolus vulgaris L.

Phaseolus genus, as well as other legumes, has proved recalcitrant plant regeneration in vitro and mainly to genetic transformation via Agrobacterium tumefaciens. Genetic transformation in this species is limited because of their genotype dependent, as well as being a process of low efficiency and poor reproducibility. There are evidences that several factors influence DNA integration and stable transformation of plants. This review aims to analyze the influence of different factors on the efficiency of genetic transformation via Agrobacterium tumefaciens in Phaseolus such as: bacterial strain, plasmid, temperature, lighting conditions, coculture time, bacterial concentration and selection marker. Keywords: common beans, DNA, legumes, transgenic plants.El género Phaseolus, así como otras leguminosas, se ha mostrado recalcitrante a la regeneración de plantas in vitro y a la transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens. La transferencia de genes en esta especie es limitada debido a su condición genotipo dependiente, además de resultar un proceso de baja eficiencia y poco reproducible. Existen evidencias que varios factores influyen en la integración del ADN y la transformación estable de plantas. Esta revisión tuvo como objetivo analizar la influencia de diferentes factores en la eficiencia de la transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens en Phaseolus vulgaris L. tales como: cepa bacteriana, plasmidio, temperatura, condiciones de iluminación, tiempo de cocultivo, concentración bacteriana y marcador de selección. Palabras clave: ADN, frijol común, leguminosas, plantas transgénicas

Efecto de parámetros que intervienen en la transformación vía Agrobacterium tumefaciens en la regeneración de Phaseolus vulgaris L. cultivares 'ICA Pijao' y 'BAT 93'

Phaseolus vulgaris is a crop widely used in human consumption. Its production is affected by the incidence of biotic and abiotic factors. Genetic transformationprovides the possibility of reducing these affections, but the low efficiency in vitro regeneration constitutes a limiting factor for the development of protocols forobtaining plants transformed in this species. The aim of this work was to determinethe effect of bacterial suspension concentration, vacuum infiltration time andco-culture on the regeneration of P. vulgaris shoots in 'ICA Pijao' and 'BAT 93' cultivars. Green nodular calli were inoculated with a suspension of A. tumefaciensat a DO600 0.1, 0.2 and 0.3. Three times of infiltration by vacuum were evaluated:1, 2 and 3 min and co-culture period of three and five days. The concentration ofthe bacterial suspension, the vacuum infiltration time and the co-culture periodaffected the regeneration of shoots of P. vulgaris cv. 'ICA Pijao' and 'BAT 93'. The highest percentages of P. vulgaris shoot regeneration were achieved by inoculatingthe calli with a bacterial suspension adjusted at DO600=0.1, without vacuuminfiltration and 3 days in co-culture. The results of this research constitute thefirst contributions to the scientific community in show the effect of vacuuminfiltration on the regeneration of P. vulgaris tissue inoculated with A. tumefaciens. Keywords:co-culture, vacuum infiltration, regeneration, bacterial suspensionPhaseolus vulgaris L. es un cultivo muy empleado en el consumo humano. Su producción se encuentra afectada por la incidencia de factores bióticos y abióticos. La transformación genética brinda la posibilidad de reducir estas afectaciones, pero la baja eficiencia en la regeneración in vitro constituye una limitante para el desarrollo de protocolos para la obtención de plantas transformadas en esta especie. El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de la concentración de la suspensión bacteriana, el tiempo de infiltración por vacío y de co-cultivo en la regeneración de brotes de P. vulgaris en los cultivares 'ICA Pijao' y 'BAT 93'. Callos nodulares verdes se inocularon con una suspensión de A. tumefaciens ajustada a DO600 de 0.1, 0.2 y 0.3. Se evaluaron tres tiempos de infiltración por vacío: 1, 2 y 3 min y tiempos de co-cultivo de tres y cinco días. La concentración de la suspensión bacteriana, el tiempo de infiltración por vacío y el período de co-cultivo afectan la regeneración de brotes de P. vulgaris cv. 'ICA Pijao' y 'BAT 93'. Los mayores porcentajes de regeneración de brotes de P. vulgaris se lograron al inocular los callos con una suspensión bacteriana ajustada a DO600=0.1, sin infiltración con vacío y 3 días en co-cultivo. Los resultados de esta investigación constituyen los primeros aportes a la comunidad científica en demostrar el efecto de la infiltración por vacío en la regeneración de tejido de P. vulgaris inoculado con A. tumefaciens. Palabras clave: co-cultivo, infiltración por vacío, regeneración, suspensión bacterian

Effect of parameters involved in the transformation via <i>Agrobacterium tumefaciens</i> in the regeneration of <i>Phaseolus vulgaris</i> L. cultivars 'ICA Pijao' and 'BAT 93'

Phaseolus vulgaris is a crop widely used in human consumption. Its production is affected by the incidence of biotic and abiotic factors. Genetic transformation provides the possibility of reducing these affections, but the low efficiency in vitro regeneration constitutes a limiting factor for the development of protocols for obtaining plants transformed in this species. The aim of this work was to determine the effect of bacterial suspension concentration, vacuum infiltration time and co-culture on the regeneration of P. vulgaris shoots in 'ICA Pijao' and 'BAT 93' cultivars. Green nodular calli were inoculated with a suspension of A. tumefaciens at a DO600 0.1, 0.2 and 0.3. Three times of infiltration by vacuum were evaluated: 1, 2 and 3 min and co-culture period of three and five days. The concentration of the bacterial suspension, the vacuum infiltration time and the co-culture period affected the regeneration of shoots of P. vulgaris cv. 'ICA Pijao' and 'BAT 93'. The highest percentages of P. vulgaris shoot regeneration were achieved by inoculating the calli with a bacterial suspension adjusted at DO600=0.1, without vacuum infiltration and 3 days in co-culture. The results of this research constitute the first contributions to the scientific community in show the effect of vacuum infiltration on the regeneration of P. vulgaris tissue inoculated with A. tumefaciens. Keywords:co-culture, vacuum infiltration, regeneration, bacterial suspensio

MEJORAMIENTO GENÉTICO EN PLANTAS AUTÓGAMAS

El avance de los métodos tradicionales y modernos para el mejoramiento de las plantas autógamas se ha incrementado en las últimas décadas, ambos métodos son las principales herramientas para conseguir incrementar la producción de los cultivos. Entre los métodos tradicionales más usados se tiene a la hibridación que se basa en el cruzamiento de individuos con diferentes genotipos, la selección; entre ellas a la selección masal, la selección por pedigree y el retrocruzamiento. En los métodos modernos tenemos: Selección asistida por marcadores moleculares, que combina muy bien con el mejoramiento tradicional; así también la Inducción de mutaciones cuando la variabilidad genética es baja; el cultivo de tejidos in vitro, la Ingeniería Genética y Mejoramiento de Genes. En el presente trabajo explicamos algunos ejemplos en plantas autógamas como en el caso de Phaseolus vulgaris “frijol” orientándose a mejora en condiciones de sequía principalmente, así como el mejoramiento genético de la Quinua, la cual presenta alogamia frecuente (0,5 a 17%), y por último tenemos el mejoramiento genético en el cultivo de arroz, utilizando marcadores moleculares para etiquetar los genes de interés. En conclusión, los métodos genéticos tradicionales nos dan alternativas sencillas y de bajo costo, aunque toman un mayor tiempo, por lo cual se está orientando a combinar los métodos tradicionales con métodos modernos. Palabras clave: Plantas autógamas, selección, hibridación, retrocruzamiento, mejoramiento genético. Abstract The advance of traditional and modern methods for the improvement of self-pollinated plants has increased in recent decades, both methods are the main tools to achieve increased crop production. Among the most widely used traditional methods, hybridization is based on the crossing of individuals with different genotypes, selection; including mass selection, pedigree selection and backcrossing. In modern methods we have: Selection assisted by molecular markers, which combines very well with traditional breeding; thus also the Induction of mutations when the genetic variability is low; in vitro tissue culture, Genetic Engineering and Gene Improvement. In the present work we explain some examples in autogamous plants such as in the case of Phaseolus vulgaris "bean", mainly oriented towards improvement in drought conditions, as well as the genetic improvement of Quinoa, which frequently presents allogamy (0.5 to 17%), and finally we have genetic improvement in rice cultivation, using molecular markers to label the genes of interest. In conclusion, traditional genetic methods give us simple and low-cost alternatives, although they take a longer time, so it is being oriented to combine traditional methods with modern methods. Keywords: Autogamous plants, selection, hybridization, backcrossing, genetic improvement. * Autor de correspondencia: E mail: [email protected] DOI: http://dx.doi.org/10.17268/rebiol.2021.41.01.1

Regeneración de plantas de Phaseolus vulgare mediante el cultivo in vitro

[ES] La judía es la leguminosa de grano más consumida a nivel mundial, tiene muchos nutrientes y un alto contenido en proteínas por lo que es muy consumida en regiones donde el acceso a la carne es limitado. Además, son bajas en grasas y tienen un elevado contenido en fibra. Uno de los principales problemas a los que se enfrenta el cultivo de la judía común es la resistencia a diversos tipos de estreses abióticos y la sensibilidad a enfermedades y plagas. Para resolver estos problemas las técnicas de mejora clásica se pueden complementar con métodos de mejora biotecnológica como las técnicas de cultivo in vitro. El cultivo in vitro comprende numerosas aplicaciones biotecnológicas como la micropropagación vegetativa, la mejora sanitaria del material vegetal o la mejora genética con técnicas como la variación somaclonal, hibridación interespecífica y cultivo de gametos. La regeneración in vitro se puede llevar a cabo mediante dos vías, la organogénesis y la embriogénesis somática. El objetivo central de este proyecto consiste en estudiar la influencia de diversos factores (ej. tipo de explante, medio de cultivo y condiciones de incubación) sobre la regeneración axilar y la inducción de organogénesis adventicia o embriogénesis somática en distintas accesiones de Phaseolus vulgaris L. para, en un futuro, poder abordar programas de mejora basados en la inducción de variabilidad genética intraespecífica (i.e. variación somaclonal) o la transformación genética.[EN] The bean is the most consumed grain legume worldwide, it has many nutrients and a high protein content, which is why it is widely consumed in regions where access to meat is limited. In addition, they are low in fat and have a high fiber content. One of the main problems facing the cultivation of common bean is resistance to various types of abiotic stresses and sensitivity to diseases and pests. To solve these problems, classical improvement techniques can be complemented with biotechnological improvement methods such as tissue culture techniques. Tissue culture includes many biotechnological applications such as vegetative micropropagation, the sanitary improvement of plant material or genetic improvement with techniques such as somaclonal variation, interspecific hybridization and gamete culture. Tissue regeneration can be carried out by two pathways, organogenesis and somatic embryogenesis. The aim of this project is to study the influence of various factors (e.g. type of explant, culture medium and incubation conditions) on axillary regeneration and the induction of adventitious organogenesis or somatic embryogenesis in different accessions of Phaseolus vulgaris L., in order to be able to tackle improvement programs based on the induction of intraspecific genetic variability (i.e. somaclonal variation) or genetic transformation, in the future.Tormos Bou, M. (2021). Regeneración de plantas de Phaseolus vulgare mediante el cultivo in vitro. Universitat Politècnica de València. http://hdl.handle.net/10251/174302TFG

Efecto del nitrato de plata (AgNO3) en la regeneración in vitro de nudos cotiledonales y epicótilos de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) Var. CENTA San Andrés.

La pasantía de investigación se realizó en el Área de Cultivo de Tejidos Vegetales del Laboratorio de Biotecnología Agrícola de la Facultad de Ciencias Agronómicas, Universidad de El Salvador. En el estudio se utilizaron dos tipos de explantes (nudos cotiledonales y epicótilos) y 4 diferentes dosis de AgNO3 suplementados en el medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) (MS) para evaluar su influencia en la respuesta regenerativa de la variedad de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) CENTA San Andrés. Para ello, se estableció un ensayo en la cual se utilizaron semillas maduras; en el cual los medios MS fueron adicionados con 30 g/L-1 de sacarosa, 3 g.L-1 de Carbón activado, 6 g.L-1 de agar, 2.5 mg.L-1 de 6-benzilaminopurina (BAP) y diferentes concentraciones de AgNO3: 0, 0.42, 1.69 y 4.25 mg.L-1. A los 28 días de iniciado el ensayo, se realizó un subcultivo y a los 42 se evaluó la respuesta morfogénica de los explantes. Los datos se analizaron mediante el Análisis de Varianza (ANOVA), en arreglo factorial de 2x4 bajo un Diseño Completamente al Azar (DCA). Se encontró que la presencia de AgNO3 no mejora la organogénesis in vitro de ninguno de los explantes utilizados de la variedad en estudio y que este efecto pudo haber sido enmascarado por la adición de carbón activado al medio de cultivo. Además, se observó una respuesta positiva al comparar los diferentes explantes y se encontró que el nudo cotiledonal tiene una mayor eficiencia regenerativa que el epicótilo. Estos resultados son preliminares, pero servirán de base para futuras investigaciones con herramientas biotecnológicas en el mejoramiento genético de la var. CENTA San Andrés la cual es una de las variedades utilizadas por los agricultores salvadoreños. Palabras claves: Frijol común, nitrato de plata, regeneración in vitro, nudos cotiledonales y epicotilos

II Simposio Regional de Biotecnología y Agroindustria y V Seminario nacional de Biotecnología

La Universidad Nacional Abierta y a Distancia –UNAD, Centro Atención Sector Agropecuario del SENA Regional Risaralda a través del Sistema de Innovación, Tecnoparque Nodo Pereira, la Universidad Libre Seccional Pereira, la Universidad Tecnológica de Pereira –UTP y las Corporación UniversitariaSanta Rosa de Cabal –UNISARC, como instituciones de educación conscientes de su compromiso en apropiación social del conocimiento a nivel regional y nacional, unieron esfuerzos para desarrollar el “II Simposio Regional de Biotecnología y Agroindustria y V Seminario Nacional de Biotecnología”, realizado en la ciudad de Pereira el día 19 de octubre de 2018. Se contó con la participación de expositores en modalidad de ponencias y presentación de póster en las siguientes temáticas biotecnológicas:1. Bioprospección, 2. Agroindustria alimentaria y no alimentaria, 3. Energías limpias, 4. Ciencias ambientales, 5. Tic aplicadas al sector productivo, 6. Desarrollo Social, 7. Ciencias de la salud y 8. Ciencias agropecuarias. Fue un evento que fortaleció las sinergias interinstitucionales entre académicos, empresarios, profesionales y futuros profesionales que a partir de estos espacios enriquecen los saberes que entregarán al desarrollo sustentable del país

Implicación del quorum sensing en las propiedades simbióticas de Rhizobium tropici CIAT 899

Universidad de Sevilla. Grado en Biologí

Caracterización molecular y funcional de genes que codifican proteínas de choque térmico (OpsHSP18, AtDjA2 y AtDjA3) de plantas bajo estrés abiótico

"El estrés abiótico es la principal causa de pérdidas de cultivos en el mundo. Sin embargo, las plantas han desarrollado mecanismos que les permiten detectar, responder y tolerar a múltiples estreses. Uno de los principales mecanismos de tolerancia al estrés en plantas, es la síntesis de proteínas de choque térmico (HSP). En este trabajo se llevó a cabo la caracterización funcional del gen OpsHSP18 de nopal (Opuntia streptacantha) que codifica una HSP de bajo peso molecular (sHSP), el cual se aisló de una biblioteca de cDNA de nopal. Líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana que sobreexpresan el gen OpsHSP18 mostraron un mayor porcentaje de germinación bajo estrés salino (NaCl) y osmótico (glucosa y manitol) y bajo la aplicación de ABA, en comparación con la WT (Col-0). Asimismo, en ensayos de tolerancia al estrés por la aplicación de NaCl o glucosa, las líneas 35S::OpsHSP18, mostraron un aumento en el porcentaje de supervivencia con respecto a Col-0. Por otro lado, en esta tesis nos enfocamos a estudiar los genes AtDjA2 y AtDjA3 de Arabidopsis que codifican para proteínas J (HSP40). Para su caracterización se obtuvieron líneas mutantes de T-DNA y se generaron líneas sobreexpresantes para ambos genes. Respecto al gen AtDjA3, se han reportado dos transcritos: el AtDjA3.1 (343 aa) y AtDjA3.2 (420 aa). La línea mutante del gen AtDjA3 mostró un fenotipo de sensibilidad a estrés salino, osmótico y tratamientos de ABA, mientras que las líneas que sobreexpresan la versión AtDjA3.2, mostraron una mayor tasa de germinación, mayor desarrollo de los cotiledones y peso fresco de las plántulas sometidas a estrés. También generamos líneas sobreexpresantes de la versión AtDJA3.1 de Arabidopsis, para su posterior análisis. En lo que respecta al gen AtDjA2, la línea mutante (j2) mostró un retraso en la germinación bajo los tratamientos de glucosa y ABA, caso contrario a lo observado en las líneas transgénicas. Este comportamiento fue también observado en el desarrollo de los cotiledones bajo la aplicación de NaCl y glucosa. Por último, con la finalidad de identificar proteínas blanco y/o interactores de las proteínas HSP, se construyeron vectores anzuelo para levadura pDHB1/OpsHSP18 y pDHB1/AtDJA2, que se utilizarán en el sistema de dos híbridos “Split ubiquitin”. Los resultados indican que ambas chaperonas de la familia HSP están involucradas en la respuesta al estrés abiótico, y una posible relación de las proteínas HSP con la ruta de señalización de ABA.""Abiotic stress is the main cause of crop loss worldwide. However, plants have developed mechanisms that allow them to detect, respond to and tolerate multiple stresses. It has been reported that in plants the synthesis of heat shock proteins (HSP) is one of the main mechanisms of stress tolerance. In this work was performed the functional characterization of OpsHSP18 gene of cactus (Opuntia streptacantha) encoding a low molecular weight HSP (sHSP). This gene was isolated from a cactus cDNA library under abiotic stress. A. thaliana 35S::OpsHSP18 over-expressing lines showed a higher germination percentage under ABA application, salt (NaCl), and osmotic (glucose and mannitol) stress, compared to the WT (Col-0). Also, wasobserved an increase in the survival rate of over-expressing plants during the application of NaCl and glucose. Moreover, from a subtractive library (SHS) of bean (Phaseolus vulgaris) under salt stress it was isolated the unigen SSHPv-S38, which encodes the protein J (HSP40). In order to characterize the AtDjA3 and AtDjA2 orthologous genes from A. thaliana, we obtained over-expressing and T-DNA lines of these genes. It is known that AtDjA3 gene produce two transcript: AtDjA3.1 (343 aa) and AtDjA3.2 (420 aa). It was observed a sensitive phenotype during abiotic stress in mutant plants of the AtDjA3 gene in compared to Col-0. The 35S::AtDjA3.2 overexpressing lines showed a tolerance under salt and osmotic stress, and ABA application. The tolerance phenotype was measured by the increase of germination percentage, cotyledons development and fresh weight of seedlings. To date, we have over-expressing lines of the version AtDjA3.1 from Arabidopsis, this line will be analyzed under abiotic stress. Regarding AtDjA2 gene, it was observed a delay in germination percentage under glucose or ABA application in the mutant line of the AtDjA2 gene, whereas, an increase in germination percentage was observed in transgenic lines. Additionally, in the 35S::AtDjA2 transgenic lines, a higher percentage of green cotyledons development was observed under application of NaCl and glucose. In order to identify possible interactors of HSP proteins, we generate bait vectors pDHB1/AtDJA2 and pDHB1/OpsHSP18, for the "Split ubiquitin" two-hybrid system in Saccharomyces cerevisiae. From the results obtained during this study, both molecular chaperones of the HSP family are involved in the response abiotic stress; and hormone ABA.