Theoretical Investigations and Microarray Applications of DNA multiplex hybridization reactions

General equilibrium and kinetic models with numerical solutions describing DNA multiplex hybridization reactions are developed and presented. Theoretical investigations on example multiplex systems were carried out in order to test the sensitivity of the model system to a variety of experimental and model parameters. A spotted microarray platform was calibrated to yield quantitative results, and the theoretical model motivated the design of an effective kinetic assay to discriminate SNPs in a multiplex fashion. Effects of duplex length, %G+C and relative position of the SNP on duplex hybridization and SNP resolution were determined. The theoretical model of multiplex hybridization accurately predicted observed results, and implicated target concentration as a critical variable in multiplex SNP detection. Hybridization intensities of 30 short duplex DNAs, measured on microarrays, were compared with solution state thermodynamic stabilities obtained by differential scanning calorimetry (DSC). A linear relationship between intensity and stability was found for perfect match and most mismatch duplexes. Examination of outliers suggested that duplex length and tandem mismatch position could be important factors contributing to observed deviations from linearity. Thermodynamic parameters for 32 duplexes containing 2X2 and 4X4 mismatches involving g/a and c/t pairs, together with 10 corresponding perfect matches, were evaluated in 85 mM, 300 mM, and 1M Na+ buffers using DSC. Negative standard heat capacity changes were found for duplexes containing ga/ag tandem mismatches and a logarithmic dependence on [Na+] was observed for all evaluated thermodynamic parameters. A detailed statistical comparison with nearest-neighbor (NN) model predictions identified gross inaccuracies in ΔH°, ΔS°, and ΔG° predictions for mismatches at all sodium ion concentrations, and perfect matches at 85 and 300 mM Na+. Tm predictions, however, were much more accurate. The purine/pyrimidine order and G+C content of flanking Watson-Crick (W/C) base-pairs was shown to influence the stability of the intervening tandem mismatch, and contextual effects beyond the adjacent flanking base pairs (W/C or not) were shown to be negligible. Since dependence of tandem mismatch stability on flanking bases precludes their incorporation into a doublet model, a model-independent perturbation approach is instead proposed for predictions of thermodynamic parameters relative to a corresponding duplex

Computer aided DNA sequence design

In der Nanotechnologie werden "bottom-up"-Konstruktionsverfahren, bei der sich Bausteine mit Größe im Nanometerbereich durch lokale Wechselwirkungen zusammenfügen, zunehmend interessant, da sie einige Probleme von "top-down"-Verfahren, bei denen solche Bausteine mit meist weit größeren Werkzeugen manipuliert werden, vermeiden. Eine wichtige erforderliche Eigenschaft für ein erfolgreiches selbsttätiges Zusammenfügen (Self-Assembly) der Bausteine ist die Programmierbarkeit des Vorgangs, d. h. durch Wahl bestimmter Eigenschaften der Bausteine kann möglichst exakt vorherbestimmt werden, zu welchen Strukturen sich die Bausteine durch die lokalen Wechselwirkungen zusammenfügen. DNA, hier unabhängig von ihrer biologischen Rolle als Träger der Erbinformation betrachtet, ist ein äußerst geeigneter Baustoff für das programmierbare Self-Assembly, da durch die Wahl komplementärer Basensequenzen von DNA-Molekülen ihr Zusammenfügen (die Hybridisierung) in gewissem Maß vorherbestimmbar ist. Leider ist diese Programmierung aber nicht perfekt deterministisch, so daß es gilt, die Basensequenzen so zu wählen, daß die gewollten Hybridisierungen möglichst wahrscheinlich und die ungewollten möglichst unwahrscheinlich sind. Die Suche nach einer Menge solcher Sequenzen bildet das DNA-Sequenz-Design-Problem. Es läßt sich in zwei Teilprobleme zerlegen: Zum Einen muß ein möglichst realistisches Modell für die Wahrscheinlichkeit der Hybridisierung zweier DNA-Moleküle gefunden werden, das trotzdem einfach zu berechnen ist. Zum Anderen muß ein Algorithmus entwickelt werden, der eine Menge von DNA-Sequenzen findet, die gemäß dieses Modells die gewünschten Strukturen mit hoher und alle anderen mit möglichst geringer Wahrscheinlichkeit bilden. Je nach Anwendung des programmierbaren Self-Assembly können Zusätzliche Anforderungen wie z. B. Einschränkungen physikalischer oder chemischer Eigenschaften der Moleküle das Designproblem erschweren. Es stellt sich nicht nur in der Nanotechnologie, sondern auch im Bereich des DNA-Computing sowie für alltägliche Molekularbiologische Methode wie DNA-Microarrays oder der Polymerasekettenreaktion. Diese Arbeit untersucht Lösungen für die genannten zwei Teilprobleme und ihre Güte in einer Reihe von Experimenten, die sowohl im Rechner als auch im Labor durchgeführt wurden. Da ein erstes Experiment gezeigt hat, daß oft verwendete Stringdistanzmaße wie Hamming-Distanz oder Edit-Distanz für die Modellierung der Hybridisierungswahrscheinlichkeit eher ungeeignet sind, wurde als Lösung für das erste Teilproblem ein Sequenzunähnlichkeitskriterium gewählt, das auf dem einmaligen Vorkommen von Subsequenzen fixer Länge beruht. Das zweite Teilproblem wurde mit einem einfachen graphbasierten Algorithmus gelöst, der die Abbildung von unähnlichen Sequenzen auf knotendiskunkte Pfade durch einen bestimmten Graphen ausnutzt. Dieser konnte durch einfache Erweiterungen auch zusätzliche Anforderungen an die Moleküle realisieren. Die Experimente zeigen, daß der Algorithmus eine zufriedenstellende Ausbeute an Sequenzen erzielt, und daß das Modell durchaus sinnvoll gewählt ist und eine Einschränkung der Hybridisierungswahrscheinlichkeit von DNA-Molekülen zuläßt

The fidelity of the tag-antitag system

In the universal DNA chip method, target RNAs are mapped onto a set of DNA tags. Parallel hybridization of these tags with an indexed, complementary antitag array then provides an estimate of the relative RNA concentrations in the original solution. Although both error estimation and error reduction are important to process application, a physical model of hybridization fidelity for the TAT system has yet to be proposed. In this work, an equilibrium chemistry model of TAT hybridation is used to estimate the error probability per hybridized tag (ϵ). The temperature dependence of _ is then discussed in detail, and compared with the predictions of the stringency picture. In combination with a modified statistical zipper model of duplex formation, implemented by the Mjolnir software package, ϵ is applied to investigate the error behavior of small to moderate sized TAT sets. In the first simulation, the fidelities of (1) 105 random encodings, (2) a recently reported Hamming encoding, and (3) an ϵ-based, evolved encoding of a 32-strand, length- 16 TAT system are estimated, and discussed in detail. In the second simulation, the scaling behavior of the mean error rate of random TAT encodings is investigated. Results are used to discuss the ability of a random strategy to generate high fidelity TAT sets, as a function of set size and encoding length