Optimierte Verfahren zur morphologischen und histochemischen Auswertung der Niere

Immersionsfixierungen von Mäuse- und Rattennieren ermöglichen nur eine ungenügende Strukturerhaltung für licht- und elektronenmikroskopische Auswertungsansätze, als Goldstandard gilt daher die Perfusionsfixierung. Etablierte Protokolle hierfür wurden in früheren Arbeiten für Glutaraldehyd-haltige Fixierlösungen erstellt, welche sich jedoch allgemein nicht für immunhistochemische Präparationen eignen. Hierfür müssen üblicherweise separate Versuchstiergruppen mit Formaldehyd-haltigen Fixierlösungen per Immersion oder Perfusion fixiert werden, was in beiden Fällen häufig mit starken qualitativen Einschränkungen der Strukturerhaltung verbunden ist. Aufgrund der verbesserten Generierung von immer neuen experimentellen Tiermodellen und neuen mikroskopischen Auswertungsansätzen wie Konfokalmikroskopie und Super-Resolution-Lichtmikroskopie besteht daher ein immer größer werdender Bedarf an hochwertig fixiertem Nierengewebe für immunhistochemische sowie ultrastrukturelle Auswertungen. Um sämtliche konventionellen licht- und elektronenmikroskopischen Methoden sowie auch immunhistochemischen und biochemischen Methoden anhand von nur einem Versuchstier durchführen zu können, optimierte ich im Rahmen meiner Dissertation die Zusammensetzung von Formaldehyd-haltigen Fixierlösungen für Perfusionsfixierungen von Mäusen und Ratten durch Anpassung der Vehikelosmolarität, des kolloidosmotischen Drucks, des Puffersystems und des Fixans. Durch diese optimierte Fixierung erreichte ich eine hochwertige Strukturerhaltung von Rinde und äußerem Mark durch zwei Standardprotokolle (Protokoll 1 mit Zusatz von Hydroxyethylstärke, Protokoll 2 ohne Zusatz von Hydroxyethylstärke), welche mit einem klassischen Protokoll zur Perfusionsfixierung mit Glutaraldehyd verglichen wurden (Protokoll 3 mit Zusatz von Hydroxyethylstärke). Im Rahmen von Variationen dieser Protokolle konnte durch verringerte Vehikelosmolarität die ultrastrukturelle Darstellung von Podozyten und kortikalen Tubuli optimiert werden, während sich eine hohe Vehikelosmolarität und ein hoher kolloidosmotischer Druck allgemein für gute Strukturerhaltung des äußeren Marks eigneten. Zusätzlich optimierte ich die Auswertung von Nierengewebe durch Anpassung der Gewebe- und Schnittpräparation sowie der verwendeten mikroskopischen Techniken. Hierfür stellte ich durch neue Präparationsansätze qualitativ hochwertige Ultradünnschnitte für großflächige Digitalisierungen mit dem Transmissionselektronenmikroskop und neuartigen Techniken per Rasterelektronenmikroskop her. Dies erhielt den räumlichen Zusammenhang komplexer Nierenstrukturen wie Glomeruli von der Übersicht bis zum hochauflösenden Detail und ermöglichte damit eine stufenlose Vergrößerung. Die Nutzung von Siliziumplättchen als Trägermaterial für Ultradünnschnitte im Rasterelektronenmikroskop zeigte viele Vorteile im Vergleich zu klassischen Grids bei der Verwendung im Transmissionselektronenmikroskop; sie vereinfachten die Probenpräparation, erhöhten drastisch die Stabilität der Präparate und ermöglichten eine großflächige Abbildung barrierefreier Ultradünnschnittareale. Die Digitalisierung von Ultradünnschnittarealen per Rasterelektronenmikroskop konnte durch Verwendung eines neuartigen Mehrstrahl-Rasterelektronenmikroskops darüber hinaus um das ca. 100-fache beschleunigt werden, wodurch komplette Ultradünnschnitte innerhalb von ca. 30 min. in guter Qualität digitalisiert wurden.Immersion fixation of rodent kidneys leads to poor structural preservation for light- and electron microscopical analysis. Thus, perfusion fixation represents the goldstandard. Therefore, protocols for glutaraldehyde containing fixative solutions were established by previous authors for optimized structural preservation of rodent kidneys. Glutaraldehyde-fixed tissue, however, is generally not suitable for immunohistochemical approaches. Therefore, separate animal groups are usually used to perform formaldehyde fixation via immersion or perfusion, both associated with severe drawbacks in structural preservation. Based on today’s versatile experimental animal models and innovative microscopy techniques, such as confocal microscopy and superresolution microscopy, there is an increasing demand on high quality fixed tissue for combined immunohistochemical and ultrastructural analysis. My aim was to provide high quality fixed tissue as a basis for all conventional light- and electron microscopical techniques as well as immunohistochemical and biochemical techniques using one single animal. Therefore, I optimized fixation solutions for perfusion fixation of mice and rat kidneys by adapting vehicle osmolarity, colloidosmotic pressure, buffer solution and fixative type. Based on this improved fixation, renal cortex and outer medulla were preserved with superior quality using two standard protocols (protocol 1 containing hydroxy ethyl starch and protocol 2 without addition of hydroxy ethyl starch). Morphology was compared to a standard protocol, containing glutaraldehyde and hydroxy ethyl starch (protocol 3). Variations of these protocols with reduced vehicle osmolarity improved ultrastructural preservation especially of podocytes and cortical proximal tubular epithelium cells, whereas raised vehicle osmolarity and colloid osmotic pressure improved ultrastructural preservation of medullary components. In addition, improvements of tissue processing and section preparation further increased overall quality. By combining new approaches in transmission- and scanning electron microscopy with my adapted tissue processing protocols, I was able to digitize large thin section areas with superior quality as compared to conventional approaches. As a result, complex microanatomical architecture was preserved in the digitized datasets, facilitating smooth zooming. Compared to traditional transmission electron microscopy, improvements of thin section processing were mainly based on a more stable preparation using silicon substrate and imaging using a scanning electron microscope. Thin section digitization was further sped up using a new and powerful multi-beam scanning electron microscope by approximately 100-fold, enabling whole thin section digitization in about 30 min. with satisfactory quality

Konzept und Implementierung eines Systems zur Visualisierung von Zelldifferenzierungssimulationen

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, zunächst den Stand der Forschung auf dem Gebiet der Zelldifferenzierungssimulatoren und –visualisierungen zu ermitteln. Davon ausgehend wurde ein eigenes Konzept für ein Visualisierungssystem entwickelt. Es wurde in einer prototypischen Implementierung mit dem Titel D-VISION umgesetzt. Die Recherchearbeiten ergaben, dass in der Forschung bisher hauptsächlich biochemische Reaktions-Netzwerke, die mithilfe von Differentialgleichungen gelöst werden, für Zell-Simulationen benutzt werden. Der dabei verwendete Abstraktionsgrad der repräsentierten Zellen ist zu hoch, um die gestellten Anforderungen einer realistischen 3D-Darstellung der Zellen zu erfüllen. Die grundlegende Idee, die Zelldifferenzierung aufgrund ihrer Genexpression also der in den Zellen vorhandenen Substanzen zu beschreiben, wurde als Basis für das Konzept für D-VISION verwendet. Die Daten, die visualisiert werden sollen, sind die Zellen selbst, die Substanzen, die in der Zelle vorhanden sind, Substanzen an der Zellhülle und die Gene, die in einer Zelle aktiv sind. Die Visualisierung wird durch Darstellung von aufeinander folgenden Standbildern vorgenommen, in denen navigiert werden kann. Zellen werden in Form von Kugeln repräsentiert, die, um eine realistischere Ansicht zu erreichen, so deformiert werden, dass sich die Kugeloberflächen aneinander angleichen. Die Deformation bietet nicht nur in der Ansicht von außen ein natürliches Bild. Auch die Möglichkeit, ein Schnittbild durch den Zellhaufen zu erzeugen, ergibt durch die Deformation eine mit realen Mikroskopieaufnahmen vergleichbare Darstellung. Ein solches zweidimensionales Schnittbild kann durch Verschieben der Schnittebene eine stufenlose Fahrt durch die Schichten des simulierten Zellhaufens zeigen. Neben den Zellen selbst, liegt ein besonderes Augenmerk auf der Darstellung von Substanzkonzentrationen. Sie werden durch kleine Objekte (Tiny Cubes) dargestellt. Allerdings unterscheidet sich ihr Einsatz von der bisher verbreiteten Methode, volumetrische Daten durch Farbskalen zu repräsentieren. Sie geben die Stoffmengen allein durch ihre Anzahl wieder. Um Zusammenhänge mit der Zelldifferenzierung erkennbar zu machen, können bis zu drei verschiedene Stoffe gleichzeitig angezeigt werden. Der Benutzer hat die Möglichkeit, Regeln bezüglich des Zustandes von Zellen zu formulieren. Die so definierten Zellklassen, fassen Zellen gleichen Typs zusammen und ermöglichen so die Darstellung von Zelldifferenzierung. D-VISION wurde konzipiert, um auch mit Simulatoren zusammen zu arbeiten, die Grid Computing für ihre Berechnungen nutzen. Ein separater Datenaufbereiter soll die Simulationsdaten verwalten. Der entwickelte Prototyp ist flexibel genug, um auch mit einfacheren Simulatoren zusammenzuarbeiten. Auf welchem Weg die visualisierten Daten gewonnen werden, spielt keine Rolle. Auch reine Messwerte, können zu guten Bildern führen

Konzept für Bildanalysen in Hochdurchsatz-Systemen am Beispiel des Zebrabärblings [Finale Version]

Bildbasierte Hochdurchsatz-Untersuchungen am Zebrabärbling setzen hohe Anforderungen an den Versuchsentwurf sowie die automatische Analyse und Interpretation. Die vorliegende Arbeit schlägt ein strukturiertes Verfahren vor und stellt neue Bildverarbeitungsmodule bereit. Die Kombination beider Teile bietet einen Lösungsweg, der Nutzsignale auswertbar macht, die Auslegung optimiert und somit Datenmenge, redundante Information, Arbeitsaufwand sowie Klassifikationsfehler reduziert

3D-Rekonstruktion von elektronenmikroskopischen Serienschnitten

In elektronenmikroskopischen, physikalischen Schnittserien ist keine Orientierung der Schnittbilder zueinander gegeben, was diese Aufnahmemethode für hochauflösende, dreidimensionale Untersuchungen zunächst ungeeignet erscheinen läßt. Die vorliegende Arbeit zeichnet jedoch einen neuen Weg vor, der die dreidimensionale Verarbeitung auch großer elektronenmikroskopischer Schnittserien zuläßt. Hierzu werden der Verlust der Orientierung und die beim Ultradünnschneiden auftretenden Stauchungen mathematisch durch allgemeine, lineare Transformationen modelliert. In einem eigens für diese Problemstellung entwickelten Programm (CAR) dienen die korrigierten, digitaliserten Querschnittsdaten der Objekte als Ausgangspunkt für die Rekonstruktion. Dem Rekonstruktionsalgorithmus ist der sog. Delaunaygraph zugrunde gelegt, der eine Zerlegung des Objektes in Tetraeder ermöglicht. Durch Einführung sog. interpolierender Punkte in die Rekonstruktion ist es möglich, auch Bifurkationen und hierarchisch geschachtelte Konturen topologisch richtig zu repräsentieren. Die in dieser Arbeit entwickelten Techniken wurden am Beispiel der sog. Calyx von Held, einer Riesensynapse im Hirnstamm der Ratte (Durchmesser ca. 20 µm) angewandt. Die Calyx wurde in 270 Ultradünnschnitte der Schnittdicke 70 nm geschnitten und mit einer Pixelauflösung von etwa 3 nm elektronenmikroskopisch erfaßt und digitalisert. Neben Volumen und Oberfläche der am Terminal beteiligten prä- und postsynaptischen Zellen wurde die Gröÿe des synaptischen Spaltes, die Anzahl, mittlere Größe und Verteilung der sog. aktiven Zonen bestimmt, die für den Vorgang der synaptischen Übertragung sehr wichtig sind. Daher werden diese Daten gemeinsam mit den Eckdaten der physiologischen Messungen als Ausgangspunkt für Reaktions-Diffusions-Simulationen der Transmittermoleküle im synaptischen Spalt dienen, welche zu einem besseren Verständnis der synaptischen Übertragung beitragen werden

Konzept f\"ur Bildanalysen in Hochdurchsatz-Systemen am Beispiel des Zebrab\"arblings

With image-based high-throughput experiments, new challenges arise in both, the design of experiments and the automated analysis. To be able to handle the massive number of single experiments and the corresponding amount of data, a comprehensive concept for the design of experiments and a new evaluation method is needed. This work proposes a new method for an optimized experiment layout that enables the determination of parameters, adapted for the needs of automated image analysis. Furthermore, a catalogue of new image analysis modules, especially developed for zebrafish analysis, is presented. The combination of both parts offers the user, usually a biologist, an approach for high-throughput zebrafish image analysis, which enables the extraction of new signals and optimizes the design of experiments. The result is a reduction of data amount, redundant information and workload as well as classification errors

Herstellung und Charakterisierung neuartiger Hybridnanostrukturen für bioanalytische Anwendungen

The impact of nanotechnology in various aspects of the daily life is continually increasing, especially as more applications for nanostructures are being discovered. Nanostructures provide a high functionality within the smallest of areas, which makes them interesting for many applications in the life sciences. Recent developments have shown that optical nanostructures have great potential within bio-analytical sensor technology (e.g. in the detection of pathogens in plants). This study focuses on the development of a novel hybrid nanostructure. This new hybrid nanostructure, consisting of non-plasmonic nanoholes and plasmonic noble-metal nanoparticles, presents an interesting platform both for biochip and biosensing technologies. A key element of the presented work is the investigation of using guided self-assembly fabrication for this hybrid nanostructure. Different methods for self-assembly, ranging from droplet evaporation to DNA-directed immobilization, are researched. Of special importance is the research into the influence of self-assembling monolayers for immobilization of nanoparticles in nanoholes, for example formed from dodecyl-phosphonic acid, for the fabrication of the nanostructure. Atomic force and scanning electron microscopes are used to characterize the hybrid nanostructures created by the self-assembling processes. Another central part of this work is the study of the optical behavior of the individual nanostructures and the change in these optical characteristics found in the assembled hybrid nanostructure. Microspectroscopic measurements and automated image processing of camera images are used for the optical characterization. An extensive number of measurements make it possible to determine the different influential factors, like size and material of the nanoparticles within the nanostructure. A statistical analysis of the optical properties of the hybrid nanostructures is also performed. The investigation of different influential factors helps to understand the optical properties of the hybrid nanostructure and helps to evaluate its applicability for bio-analytical applications. Based on the knowledge gained from these results, the new nanostructure is tested with different model substances. The proof-of-principle experiment with a biologic relevant test system (e.g. DNA) shows the nanostructure's suitability for the detection of molecules. Additionally the imaging spectrometer, setup within this project, shows the possibility of fusing the high spectral resolution of a spectrometer with the high data throughput obtained with image processing. The imaging spectrometer is therefore ideally suited for the characterization of optical nanostructures.Die Nanotechnologie dringt immer stärker in viele Bereiche unseres Alltagsleben vor, zumal immer mehr Anwendungsmöglichkeiten von Nanostrukturen erforscht werden. So bieten Nanostrukturen eine hohe Funktionalität auf kleinstem Raum, die sie unter anderem auch für Anwendungen in den Lebenswissenschaften interessant machen. Neueste Entwicklungen haben gezeigt, dass insbesondere optische Nanostrukturen ein großes Potential für die bioanalytische Messtechnik besitzen (z.B. Erkennung von Krankheitserregern in Pflanzen). An diesem Punkt setzen die Untersuchungen für die in dieser Arbeit entwickelte Hybridnanostruktur an. Diese neuartige Nanostruktur, bestehend aus nicht\-plasmonischen Chrom-Nanoholes und plasmonischen Edelnanopartikeln, stellt eine interessante Plattform sowohl für die Biochiptechnologie als auch für die biologische Sensorik dar. Ein Kernpunkt dieser Arbeit sind daher Untersuchungen zur Herstellung dieser Hybridnanostruktur mittels geführter Selbstorganisation. Dabei werden verschiedene Varianten betrachtet, die von einer Assemblierung mittels eintrocknenden Tropfens bis zur DNA-geführten Immobilisierung reichen. Von besonderer Bedeutung ist die Untersuchung des Einflusses verschiedener selbstorganisierender Monolagen wie zum Beispiel Monolagen aus Dodecyl-Phosphatsäure. Die Ergebnisse der Immobilisierungsversuche werden mittels Rasterkraft- und Rasterelektronenmikroskopie charakterisiert und anhand dessen beurteilt. Ein weiteres zentrales Element der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung der optischen Eigenschaften der einzelnen Nanostrukturen sowie deren Änderung nach der Assemblierung der entwickelten Hybridnanostruktur. Die optische Charakterisierung erfolgt mittels mikrospektroskopischer Messungen an einzelnen Nanoholes und automatisierter Bildauswertung von Kameradaten. Anhand dieser umfangreichen Messungen können verschiedene Einflussparameter wie Größe und Material der Nanopartikel untersucht und die optischen Eigenschaften der Hybridnanostruktur statistisch bewertet werden. Zusätzlich konnte mit dem Aufbau eines bildgebenden Spektrometers gezeigt werden, dass die Verbindung einer hohen spektralen Auflösung eines Spektrometers mit dem hohen Datendurchsatz der Bildauswerteverfahren möglich ist und dass sich das bildgebende Spektrometer für die Messung optischer Nanostrukturen bestens eignet. Es konnte mittels unterschiedlicher Modellsubstanzen gezeigt werden, dass sich die Hybridnanostruktur als bioanalytische Testplattform eignet. Abschließend konnte anhand von biologisch relevanten Testsystemen gezeigt werden, dass diese Plattform sehr gut zur Detektion von Molekülerkennungsreaktionen (z.B. DNA) in der Bioanalytik geeignet ist

Interactive simulation and visualisation for the computerised biochemistry

Die moderne Biochemie ist eine Wissenschaft, die sich im Wandel befindet. Während die bisherige Forschung sehr stark experimentell geprägt ist, existiert eine theoretische Biologie, analog zur theoretischen Chemie, nur in Ansätzen. Trotzdem wandelt sich auch diese Wissenschaft hin zu einer stärkeren Einbindung theoretischer Ansätze. Der Grund hierfür liegt in der Betrachtung von zunehmend komplexeren Systemen. So beschäftigt man sich in der Systembiologie, einem Teilbereich der Biochemie, unter anderem mit der Aufklärung komplexer Reaktionsnetzwerke. Während Ausschnitte dieser Netzwerke weiterhin experimentell aufgeklärt und verstanden werden, lässt sich das zusammenhängende Bild zunehmend nur noch durch eine theoretisch geprägte Modellbildung fassen. Darüber hinaus zeigen neuere Forschungsergebnisse die Bedeutung der Tatsache, dass Moleküle, Zellen und Zellhaufen, also wichtige Forschungsubjekte der Biochmie, dreidimensionale Gebilde sind – eine Tatsache, die bei der Modellbildung berücksichtigt werden muss. Eine Antwort auf die genannten Herausforderungen ist der konzertierte Einsatz von Simulation und Visualisierung als Mittel des Erkenntnisgewinns. Damit ist die Informatik gefordert entsprechende dedizierte Werkzeuge zu entwickeln, die Simulation, Visualisierung und Interaktion im Kontext des von der Anwendungsdisziplin gesetzten räumlich-zeitlichen Problemkreises miteinander verbinden. In dieser Arbeit wird ein integriertes Konzept zu Simulation, Interaktivität und Visualisierung vorgelegt, das auf einer Anforderungsanalyse in Bezug auf Anforderungen an die Simulation und Anforderungen an die Interaktivität und Visualisierung basiert. Zur Lösung der aufgeworfenen Probleme wird ein „Baukastensystem“ auf Basis von Multi-Agenten-Systemen vorgeschlagen. Die Auswahl des geeigneten Simulationsverfahrens, z. B. die Auswahl eines stochastischen Verfahrens gegenüber einem deterministischen Verfahrens, wird so zur Auswahl eines Bausteins, wobei gezeigt wird, wie z. B. mit Hilfe von Regeln die Auswahl auch automatisiert werden kann. Ebenso wird gezeigt, wie man „Baussteine“ auch im räumlichen Sinne verstehen kann, als Dinge, die in einem dreidimensionalen Kontext einen bestimmten Raum einnehmen und die, in ihrer Gesamtheit betrachtet, den Beobachtungsraum der Simulation ausfüllen. Diese Bausteine finden sich entsprechend ebenfalls im Kontext der Interaktion wieder. Ein wichtiger Aspekt in diesem Baukastenkonzept ist die Frage der Kommunikationsstruktur und des Kommunikationsprotokolls, für den ein Vorschlag erarbeitet wird. Das entwickelte Gesamtkonzept besteht aus zwei Teilen: Einem Konzept für Ein- und Ausgabegeräte mit einer gemeinsamen Metapher, die die Geräte logisch in den Anwendungskontext einbettet und einem Simulations- und Visualisierungskonzept auf der Basis der Kopplung heterogener intelligenter Agenten in eine gemeinsame Simulationsumgebung. Hierfür wurde ein spezieller Dialekt einer Agentenkommunikationssprache entwickelt, der dabei insbesondere den Aspekt der dreidimensionalen Visualierung einer solchen Simulation berücksichtigt.Modern biochemistry is a science is changing rapidly. While traditional research in this field is characterised by experimental studies, there is a growing interest in the inclusion computerised, model and simulation based methodologies. Although the objects of research are three dimensional entities, like molecules, cells etc. and a number of phenomena within these entities are identified as three dimensional, many models used nowadays abstract from this three-dimensionality. This is, at least to a significant part, due to the lack of dedicated visualisation and simulation tools. This thesis presents an integrated concept for the interactive simulation and visualisation in the biochemistry domain of molecular modelling, systems biology and multi-cellular structures which is based on a thorough requirements analysis. The concept consists of a modular system based on multi-agent methodologies. It is shown how this system can be used to couple heterogeneous simulation models and how three-dimensional structures can be represented in a modular way. These modular building blocks are revisited in the context of the inteactive visulisation of simulation studies. The concept is based on a newly developed agent communication language dialect. The implementation of the concept is twofold: a new I/O device, the virtual glove box, allowes for an intuitive approach to the simulation infrastructure, while several integrated software systems built on the communication structure provide a suited simulation and visualisation infrastructure wich caters for the needs of simulating three-dimensional phenomena

WebTed : ein System für Webbasierte Telediagnostik

Es wird das WebTed-System für webbasierte Telediagnostik vorgestellt. Es unterstützt drei Aspekte der Telepathologie: statische, dynamische und quantitative Telepathologie. Statische Telepathologie wird für Expertenkonsultationen eingesetzt. Mit einem Webbrowser werden klinische Daten und Bilder zu einem Fall durch einen Referenten auf einem Server abgelegt. Ein auf dem Server abgelegter Fall wird entweder durch einen einzelnen Konsultanten befundet oder durch mehrere Experten gemeinsam in einer Konferenzsitzung. Nachteil dieser Telepathologie ist die feste Vorgabe der Ausschnitte eines Präparats. Diesen Nachteil behebt die dynamische Telepathologie. Der Konsultant bedient ein ferngesteuertes Mikroskop und hat selber die Kontrolle über die Bildselektion. Dabei lassen sich alle wesentlichen Funktionen des Mikroskops wie z.B. Fokus, Objektiv und Licht ferngesteuert bedienen. Zweck der quantitativen Telediagnostik ist die Bestimmung von Parametern zur Beschreibung von Gewebestrukturen wie z.B. der Zellmorphologie (Form, Struktur, Verteilung, Häufigkeit) oder molekularbiologischen Parametern (Aktivität des H19 Gens), die zu einer Objektivierung der Diagnose beitragen: Die Bestimmung dieser Parameter wird vollautomatisch vom Computer durchgeführt und ist deshalb nicht durch die Subjektivität eines Pathologen beeinflußbar. Als Client wird ein vom Webserver heruntergeladenes Java Applet verwendet, mit dem man Zugriff auf die statische, dynamische und quantitative Telepathologie hat. Auf dem Server wird eine SQL-Datenbank zur Speicherung von Daten zu Bildern und Fällen eingesetzt, ein Konferenzserver koordiniert den Datenaustausch zwischen den Clients während der Onlinekonsultationen, ein CORBA ORB stellt ein Modul zur Fernsteuerung eines Mikroskops für die dynamische Telepathologie bereit, und die Bildverarbeitungskomponente wird für die quantitative Analyse der Bilddaten im Rahmen der quantitativen Telepathologie eingesetzt