Modularization of glycosyltransferases and studies on high-throughput activity screening

Glykosyltransferasen (GT) katalysieren die Kondensation zwischen einem Zucker und einem weiteren Zuckermolekül oder einem Aglykon. Die Enzyme der Superfamilie GT-A und GT-B besitzen zwei Domänen, die durch eine Linker-Region (LR) miteinander verbunden sind. Die eine Domäne bindet den Zuckerdonor, die zweite Domäne bindet den Zuckerakzeptor. Aus dieser Struktur ergibt sich die Möglichkeit die Domänen verschiedener GT miteinander zu kombinieren, um Enzyme mit neuer Reaktivität zu erzeugen. Ziel der Arbeit war die Kombination der Zuckerakzeptor-Domäne der Hydrochinon-Glucosyltransferase (AS) mit geringer Substratspezifität und der Zuckerdonor-Domäne der Kämpferol-3-O-Galactosyltransferase (GalT) mit hoher Substratspezifität. Hierzu sollte eine Gen-Bibliothek chimärer GT erstellt werden. Der Aktivitätsnachweis sollte im Hochdurchsatz (HTS) etabliert werden. Für die Herstellung einer Gen-Bibliothek für chimäre GT mit definierten FP in der LR wurde die One-pot fusion-PCR entwickelt. Die Methode ITCHY wurde verwendet, um eine Bibliothek chimärer Gene mit zufälligen FP in der LR zu generieren. Alle Konstrukte wurden in E. coli exprimiert. Der Aktivitätsnachweis der heterolog exprimierten Ausgangsenzyme wurde geführt, indem die gebildeten Glykoside mittels HPLC-DAD nachgewiesen wurden. Die Reaktionsbedingungen wurden vereinheitlicht und es wurde gezeigt, dass beide Enzyme unter identischen Bedingungen analysiert werden können. Für den Nachweis im HTS wurde die mit der Glykosylierung verbundene Protonenfreisetzung mit einem pH-Indikator verfolgt. Keines der untersuchten Verfahren erwies sich für das HTS als verlässlich genug. Daher wurde für die AS eine HPLC-ESI-MS/MS-Methode zum Nachweis von p-Arbutin erarbeitet, welche auf Extrakte von E. coli mit chimären Konstrukten übertragen wurde. Die Identifizierung einer aktiven chimären GT gelang nicht. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die ICHTY-Technik eine zeitsparende Methode zur Erzeugung einer Gen-Bibliothek für chimäre GT darstellt. Um aktive Chimäre zu erzeugen, muss die Methode so optimiert werden, dass mehr chimäre Konstrukte entstehen, deren LR eine ähnliche Größe besitzt wie die LR der Ausgangsgene. Der pH-basierte Aktivitätsnachweis ist prinzipiell im HTS möglich, führt aber oft zu falsch-positiven Ergebnissen. Der spezifische Produktnachweis mittels HPLC-DAD und HPLC-ESI-MS/MS erscheint auf der Basis der vorliegenden Untersuchungen die Methode der Wahl für die Aktivitätsbestimmung im HTS zu sein.Glycosyltransferases (GT) catalyze the condensation between a sugar and another sugar molecule or an aglycone. Enzymes of the superfamilies GT-A and GT-B possess two domains which are connected by a linker-region. One domain binds the sugar donor, the other domain binds the sugar acceptor. This structure opens the possibility to combine domains of different GTs to obtain enzymes with new reactivities. This study was aimed at combining the sugar acceptor-domain of hydroquinone-glucosyltransferase with low substrate specificity with the sugar donor-domain of kaempferol-3-O-galactosyltransferase with high substrate specificity. Therefor a gene library for chimeric GTs had to be generated. To identify active chimeric GTs a high-throughput screening (HTS) had to be established. In order to obtain gene constructs for chimeric GTs with a defined fusion site within the linker-region, the One-pot fusion-PCR was developed. The ITCHY technique was applied to generate a library of chimeric genes with random fusion sites within the linker region. All constructs were expressed in E. coli. Enzyme activity was first shown for the heterologously expressed wildtype enzymes by HPLC-DAD detection of glycosides produced in enzyme assays. Reaction conditions were then unified and it was demonstrated that both enzymes can be analyzed with identical reaction conditions. For HTS, proton release during glycosylation was monitored by means of a pH- indicator. However, the method was not reliable enough to be used in HTS. Therefore, an HPLC-ESI-MS/MS method was established for the detection of the hydroquinone-glucosyltransferase product p-arbutin. This method was applied to screen crude extracts of E. coli containing chimeric constructs. However, no active chimeric GTs were identified. The results of this study show that ITCHY is a time-saving method to create a gene library for chimeric GTs. In order to obtain an active chimera, this method has to be improved to obtain more chimeras with a linker-region of similar length as found in the parental GTs. Although the pH-based assay seemed to be principally applicable, the number of false-positive results was too high for use in HTS. Glycoside detection by HPLC-DAD and HPLC-ESI-MS/MS is characterized by high sensitivity and correct assignment of samples with active enzyme. HPLC-ESI-MS/MS appears to be the most suitable method for high-throughput screening to identify active chimeric GTs based on this study

Charakterisierungsstudien der biologischen und neurotrophen Eigenschaften des cerebral dopamine neurotrophic factor (CDNF)

Neurotrophe Faktoren ermöglichen das Überleben von Neuronen auch unter pathologischen Stressbedingungen sowie eine erneute Proliferation neuronaler Zellstrukturen nach Beschädigung. Neurotrophe Faktoren sind definiert als sekretierte Proteine. Sie werden nach Strukturhomologien, Rezeptoren und Signaltransduktionswegen in verschiedene Familien unterteilt. Die Bezeichnung „neurotropher Faktor“ umfasst Proteine mit unterschiedlichsten Funktionen. Die neurotrophen Eigenschaften von CDNF, das zur CDNF/MANF Proteinfamilie gehört, wurden durch intrastriatale Injektion und darauf folgende Protektion und Proliferation von Neuronen in einem in vivo Schädigungsmodell nachgewiesen. Diese Proteinfamilie könnte somit einen neuen Ansatz zu einer Therapiemöglichkeit von neurodegenerativen Krankheiten bieten. CDNF und MANF haben ein Molekulargewicht von ungefähr 21 kDa. Der Aminoterminus enthält eine globuläre Saposin-ähnliche (saposin like protein SAPLIP)-Domäne, und der Carboxyterminus ist verwandt mit der Sequenz von scaffold attachment factors (SAFs) und enthält analog zu SAFs eine redoxaktive Cysteinbrücke eingebettet in ein CXXC-Motiv. Die biologische Funktion, Rezeptoren und Wirkmechanismus der Neuroprotektion der CDNF/MANF Proteinfamilie sind bisher unbekannt. In dieser Arbeit wurden unterschiedliche Versuche zur Charakterisierung der Eigenschaften von CDNF und dessen SAPLIP-Domäne unternommen. Für alle Versuche waren umfangreiche biotechnologische Vorarbeiten notwendig, die in der Forschungsabteilung von CSL Behring, Marburg vorgenommen wurden. Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der Überprüfung der These, dass CDNF, ausgehend von seiner SAPLIP-Domäne, transduktorische Eigenschaften besitzen könnte: Makromoleküle in Zellen zu schleusen, ist durch die selektiv durchlässige Zellmembran nur sehr beschränkt möglich. Diese Restriktionen erlauben nur einem sehr kleinen Teil möglicher therapeutischer Substanzen den Zugang ins Zellinnere. Die natürliche Struktur von beispielsweise Proteinen verhindert das passive Eindringen dieser Stoffe in die Zelle. In den 1980er Jahren wurden jedoch Peptidsequenzen entdeckt, die als Molekültransporter Makromoleküle in das Zellinnere schleusen können. Die N-terminalen Domäne von CDNF besitzt nicht die klassische Struktur proteinogener Molekültransporter, sie ist jedoch verwandt mit Saposinen. Saposine und Saposin-ähnliche Domänen weiterer Proteine können Lipide binden oder Zellmembranen permeabilisieren. Diese Eigenschaften führten zu der These, dass auch die SAPLIP-Domäne von CDNF potentielle transduktorische Funktionen ausüben könnte. Zur Überprüfung der These wurden CDNF-Fusionsproteine biotechnologisch produziert und auf ihre transduktorischen Eigenschaften untersucht. Es konnte aber keine Transduktion von CDNF oder Assoziation mit der Zellmembran detektiert werden. Der zweite Teil der Arbeit zeigt die zelluläre Lokalisation von nativem CDNF. CDNF wird als sekretierter neurotropher Faktor beschrieben. Die C-terminale KTEL-Sequenz von CDNF weist jedoch eine große Ähnlichkeit zum allgemeinen ER-Retentionssignal KDEL auf. Wir zeigen in dieser Arbeit mit unterschiedlichen Methoden zum ersten Mal, dass CDNF tatsächlich im ER retardiert wird. Es wurden weiterhin CDNF-Mutanten mit verändertem CTerminus produziert. Die CDNF-Mutante mit C-terminaler KDEL-Sequenz und natives CDNF konnten nicht im Überstand von transfizierten Säugetier-Zellkulturen detektiert werden. Im Gegensatz zu CDNF-Mutanten mit deletiertem, maskiertem oder anderweitig verändertem C-Terminus, die im Kulturüberstand nachweisbar waren. Dieser Vergleich mit unterschiedlichen CDNF-Mutanten zeigt die wichtige Funktion einer freien C-terminalen KTEL-Sequenz bei der zellulären Lokalisation von CDNF. Der dritte Teil der Arbeit beschäftigt sich mit den neurotrophen Eigenschaften von CDNF in vitro. Nach erfolgreicher Protektion sollte durch molekulare und biochemische Methoden der unbekannte Mechanismus der neuroprotektiven Wirkung von CDNF näher untersucht werden. Verschiedene neuronale Zellkulturen wurden dafür mit 6-Hydroxydopamin oder Glutamat geschädigt. Rekombinant hergestelltes CDNF oder dessen SAPLIP-Domäne wurden extern zugeführt und der Einfluss der zugesetzten Proteine analysiert. Im Gegensatz zu den vorherigen Ergebnissen in vivo, konnte in keinem der verwendeten in vitro Systeme eine signifikante Protektion oder Proliferation durch CDNF beobachtet werden

Analysis of microbial communities and their natural and induced shifts by separation of ribosomal nucleic acids.

In der vorliegenden Arbeit wurde die bakterielle Diversität in den Habitaten Boden, Rhizosphäre und Rizoplane von Luzerne in Gewächshäusern durch Auftrennung amplifizierter eubakterieller 16S rDNA und rRNA-Fragmente anhand der Temperatur Gradienten-Gelelektrophorese (TGGE) untersucht. Ziel war die Analyse des Ausmaßes der Beeinflussung durch eine Inokulation mit dem durch eine luc-Markierung gentechnisch veränderten Sinorhizobium meliloti Stamm L33 - der sich wie der Wildtypstamm verhält - im Vergleich zu der natürlichen Variabilität der bakteriellen Gemeinschaft in Abhängigkeit der Faktoren Pflanzenart, Bodentyp und zeitliche Entwicklung der Pflanze. Hierzu wurden die TGGE-Muster der bakteriellen Gemeinschaften von Roggen, Bohne und Klee verglichen mit denen von Luzerne, die in drei verschiedenen Bodentypen angezogen und zu verschiedenen Wachstumsphasen geprobt wurden. Anhand von Clusteranalysen zeigte sich, daß in der Bodenfraktion der Bodentyp den größten Einfluß auf die bakterielle Gemeinschaft hatte, während in der Rhizosphäre und Rhizoplane der Pflanzenfaktor dominierte. Die durch eine Inokulation mit S. meliloti L33 bedingten Veränderungen lagen in der selben Größenordnung wie die zeitliche Variabilität der bakteriellen Gemeinschaft in Abhängigkeit des Pflanzenwachstums. Diese Veränderungen waren aber deutlich geringer als die durch den Bodentyp oder die Pflanzenart bedingten Effekte. Anhand der Verwendung eines spezifischen TGGE-Primers konnte jedoch in einem Bodentyp eine stärkere Beeinflussung durch eine Inokulation bei zu L33 verwandten Rhizoplanebakterien (Verwandtschaft zu S. meliloti und Rhizobium leguminosarum) aufgezeigt werden.The bacterial diversity and population dynamics in the bulk soil, rhizosphere and rhizoplane of alfalfa grown in greenhouses was studied by temperature gradient gel electrophoretic (TGGE) analysis of amplified 16S rDNA and 16S rRNA-fragments using eubacterial specific primers. The aim of this study was to analyse effects of an inoculation of the luc-marked genetically engineered Sinorhizobium meliloti strain L33 - which caused change comparable to those by the unmodified wild-type strain - on the microbial community and to compare these effects with the variability of microbial communities due to the factors crop species, soil origin and plant development. Therefore, TGGE-pattern of the microbial communities of rye, bean and clover were compared to those of alfalfa - cultivated in three different soil types and at different plant growth stages. Cluster analysis of the pattern indicated that in the bulk soil, the most important factor affecting the microbial community was the soil type, while in rhizosphere and rhizoplane the plant species became the most important factor, followed by the soil type. Shifts in the microbial community of alfalfa due to the inoculation with S. meliloti L33 were in the same order of magnitude as the temporal dynamic of the community due to plant development. In all examined habitats, these shifts were clearly minor compared to the effect of crop species and soil origin. By using a specific TGGE-primer, a stronger influence of rhizoplane bacteria closely related to the inoculated strain - namely sequences related to S. meliloti and Rhizobium leguminosarum - could be detected in case of an inoculation in one soil type

Mitochondriale Genom- und Expressionsanalysen zur Charakterisierung der CMS-Systeme Tournefortii, Juncea und Tokumasu des Raps (Brassica napus L.)

[no abstract

Analysis of copper-containing Amine oxidases in Pyrrolizidine Alkaloid producing Plants

Zu den Sekundärstoffwechselprodukten zählen die Pyrrolizidin-Alkaloide (PAs). Sie werden von einigen wenigen Pflanzen zur Verteidigung gegen Herbivoren konstitutiv gebildet. Es sind Esteralkaloide, die aus einer Necinbase und einer Necinsäure aufgebaut sind. Die Bildung der Necinbase in der PA-Biosynthese ist bis zur Homospermidinsynthase aufgeklärt worden. Diese verbindet den Primär- mit dem Sekundärstoffwechsel und bildet aus Putrescin und Spermidin Homospermidin (Hspd). Die weiteren Schritte bzw. Enzyme zur Bildung der Necinbase sind noch nicht aufgeklärt worden. Man nimmt an, dass es sich bei dem Hspd-umsetzenden Enzym um eine kupferhaltige Aminoxidase (CAO) handelt. Um das Hspd-umsetzende Enzym zu identifizieren, wurden die PA-Pflanzen Senecio vernalis und Eupatorium cannabinum mit verschiedenen Methoden untersucht. Es wurden drei CAO-homologe Sequenzen in S. vernalis und eine CAO-homologe Sequenz/ein CAO-homologes 3'Ende in E. cannabinum mit Hilfe der PCR-Techniken identifiziert. Nach Klonierung und heterologen Expression von zwei S. vernalis-Sequenzen in E. coli sind Inclusion bodies entstanden. Zur Gewinnung von aktivem Protein wurde die Expression in Pichia pastoris, die Co-Expression mit Chaperonen sowie die Solubilisierung und Rückfaltung der Inclusion bodies angewandt. Es wurde ein radioaktiver Aktivitätstest für CAOs etabliert. Dabei stellte sich ein großer Einfluss von Wasserstoffperoxid und Sauerstoff heraus. Über Signalpeptidanalyse wurden die drei S. vernalis-Sequenzen in den Peroxisomen in der Zelle lokalisiert. Mit der FPLC wurden Hspd-umsetzende Enzyme aus Wurzelrohextrakten angereinigt. Weitere Strategien wie Laser-Capture-Microscopy und differentielle PCR in Kombination mit Western-Blot-Analyse wurden angetestet.Pyrrolizidine alkaloids (PAs) belong to the class of secondary compounds. There are constitutively produced in some special plants as a defence against herbivores. They are ester alkaloids which consist of a necine base and a necine acid. The formation of the necine base in the biosynthesis of PAs is investigated until the homospermidine synthase which connects the primary with the secondary metabolism. The homospermidine synthase catalyses the formation of homospermidine (hspd) out of putrescine and spermidine. The further steps and enzymes of the formation of the necine base are not identified. It is postulated that the enzyme that uses hspd as substrate should be a copper-containing amine oxidase (CAO). To find the enzyme that uses hspd as substrate the PA plants Senecio vernalis and Eupatorium cannabinum were analysed with several techniques. Three CAO homologues sequences of S. vernalis and one CAO homologue sequence/one CAO homologues 3'end of E. cannabinum were identified with PCR methods. Inclusion bodies were formed after cloning and heterologous expression of two S. vernalis sequences in E. coli. To get active proteins the expression in Pichia pastoris, the co expression with chaperones and the solubilisation and refolding of the inclusion bodies were tested. A radioactive assay for CAOs was established. A great influence of hydrogen peroxide and oxygen was turned out. The three S. vernalis sequences were located in the peroxisomes with signal peptide analysis. With FPLC technique the hspd using enzymes of root extracts were partly purified. Further methods like laser capture microscopy and differential PCR in combination with western blot were used